Adherencia e invasión de campilobacterias termotolerantes en células HEp-2.

Thermophilic campylobacter species adherence and invasion in HEp-2 cells.

Velasco Carrillo, J.*; Vizcaya Delgado, L.*; Nieves Blanco, B.* y Pérez Schael, I.**
* Departamento de Microbiología y Parasitología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Farmacia, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.
** Instituto de Biomedicina, MSDS, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Resumen

Las campilobacterias termotolerantes son causa frecuente de enfermedad diarreica aguda en niños en todo el mundo. En el presente estudio se evaluaron dos de los factores de virulencia de importancia en enteropatógenos: la capacidad de adherencia e invasión en células HEp-2 de diferentes especies de Campylobacter (C. jejuni subsp. jejuni, C. coli y C. lari), aisladas como único enteropatógeno de niños menores de 5 años con diarrea inflamatoria y secretora; además, se incluyeron aislados de niños asintomáticos. Los resultados no revelaron diferencia estadísticamente significativa en la adherencia e invasión de los aislados de ambos grupos de niños (diarrea y asintomáticos), ni entre los aislados de diarrea inflamatoria y secretora. La variación en las manifestaciones clínicas en estos pacientes y la presencia de portadores asintomáticos podría atribuirse a diferencias en el huésped, es decir, participación activa de la respuesta inmune, o al tipo de cepa involucrada, ya que se han descrito otros factores de virulencia en estos microorganismos.

Palabras-clave: Campylobacter, adherencia, invasión, patogenicidad, virulencia.

Abstract

Thermophilic Campylobacter species are frequent causes of acute diarrhea in children around the world. In the present study, two important virulent factors in enteropathogens were evaluated. They were the adherence and invasion capacity of HEp-2 cells in different species of Campylobacter (C. jejuni subsp. jejuni, C. coli and C. lari) isolated as the only enteropathogen in children less than 5 years of age with inflammatory and secretory diarrhea. Moreover, isolated asymptomatic children were included. The results did not reveal a significant statistical difference in the adherence and invasion of those isolated in both groups of children (diarrhea and asymptomatic) or between those isolated from inflammatory and secretory diarrhea. The variation in clinical manifestations in these patients and the presence of asymptomatic carriers can be attributed to differences in the host; that is, active participation of the immune response or the type of strain involved, given that other virulent factors in these microorganisms has been described.

Introducción

Las campilobacterias termotolerantes pertenecen al género Campylobacter, el cual comprende un grupo de bacilos Gram-negativos, microaerófilos, de forma curva o espiral y con flagelo polar, que se caracterizan por crecer a 42°C; de allí su nombre (1, 2). Actualmente, son causa frecuente de enfermedad diarreica aguda (EDA) en niños en todo el mundo (3-9). Aún no está claro el mecanismo mediante el cual la bacteria produce la enfermedad (10, 11); sin embargo, existen evidencias clínicas de invasión del epitelio intestinal en casos de enteritis por C. jejuni, observándose sangre y células inflamatorias en las heces (12). Diversas investigaciones in vivo en modelos experimentales (13-15) e in vitro en diferentes líneas celulares de mamíferos (16-22) han confirmado el potencial de adherencia e invasión de estos microorganismos, sugiriendo este último como un modelo para discriminar cepas de diferentes cuadros clínicos. El presente estudio se realizó para conocer la capacidad de adherencia e invasión de campilobacterias termotolerantes en células HEp-2, aisladas como único enteropatógeno de niños menores de cinco años con diarrea (inflamatoria y secretora) y de niños asintomáticos.

Materiales y Métodos

Cepas bacterianas:
El estudio se realizó con los siguientes aislados provenientes de niños menores de 5 años (6): C. jejuni subsp. jejuni (D-334), C. coli (D-97, D-281) y C. lari (D-184, D-282). En estos pacientes Campylobacter se aisló como patógeno único asociado a la EDA. Se incluyeron en el estudio cepas aisladas de niños asintomáticos: C. jejuni subsp. jejuni (C-94), C. coli (C-77) y C. lari (C-94). Y como cepa de referencia C. jejuni subsp. jejuni 8006094 del Instituto Pasteur-BioMérieux (Lyon, Francia).

Las cepas se cultivaron en el medio sin sangre, agar Preston modificado, en atmósfera microaerofílica (frasco con la vela) a 42ºC durante 48 horas (6).

Adherencia e invasividad en células HEp-2:
La capacidad de adherencia e invasión de las cepas de Campylobacter se estudió utilizando la metodología descrita por Konkel y Joens (19) modificada en el laboratorio y la línea celular HEp-2 (ATCC CCL23) de carcinoma de epidermis de laringe humana, donada por la Dra. Irene Pérez, del Instituto de Biomedicina, Caracas, Venezuela. El experimento se realizó tres veces en forma consecutiva.

Las células HEp-2 se mantuvieron en medio esencial mínimo (Gibco, BRL) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco, BRL), 1% de l-glutamina (Gibco, BRL), 50 U/ml de penicilina G (Gibco, BRL), 50 µg/ml de estreptomicina (Gibco, BRL) y 2,55 µg/ml de anfotericina B (Gibco, BRL). Las células se subcultivaron rutinariamente en frascos plásticos para cultivo de tejido (Nunc, Denmark), se incubaron en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37ºC.

El ensayo de adherencia e invasión se realizó de acuerdo a los siguientes pasos:

1. Para la preparación de las placas de adherencia e invasión, un cultivo confluente se tripsinizó (tripsina-EDTA, Gibco, BRL), se ajustó a una densidad de 5,0 x 104 células/ml, y luego se transfirió a las placas de microdilución de 24 pozos (Nunc, Denmark). Las placas con la suspensión celular, y se incubó a 37ºC con 5% de CO2 y atmósfera húmeda durante 48 horas. Antes del ensayo, la capa semiconfluente se lavó con buffer fosfato salino (PBS) e incubada en medio esencial mínimo (MEM) con 1% de suero fetal bovino (SFB).

2. Las bacterias se recolectaron de la placa de agar Preston modificado con PBS, se centrifugaron a 8.500 rpm durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento se resuspendió en MEM con 1% de SFB hasta aproximadamente 108 bacterias/ml. De esta suspensión, se inocularon 0,5 ml en pozos por duplicado, los cuales contenían la capa semiconfluente de células HEp-2. El título de la suspensión bacteriana fue determinado retrospectivamente sobre placas de agar Preston modificado. La monocapa infectada se incubó durante 3 horas a 37ºC con 5% de CO2 y atmósfera húmeda, para permitir la adherencia de las bacterias a las células.

3. Posteriormente al período de incubación, la monocapa se lavó 5 veces con PBS, se agregó 0,5 ml de MEM con 1% de SFB y se reincubaron por 3 horas bajo las mismas condiciones, para permitir la invasión de las células. Al finalizar este período, se descartó el MEM con 1% de SFB.

4. Para la enumeración de bacterias intracelulares, a uno de los pozos se agregó MEM con 1% SFB y 250 µg/ml de gentamicina (Laboratorios Valmorca), en el otro pozo se agregó medio sin antibiótico para cuantificar el número de bacterias intra y extracelulares, las placas se incubaron durante 3 horas bajo las mismas condiciones.

5. Posteriormente, la monocapa se lavó tres veces con PBS y se lisó con 0,2 ml de triton X-100 (Sigma) al 1% en PBS durante 20 minutos (23). La suspensión se diluyó y se determinó el número de bacterias viables por contaje de unidades formadoras de colonia (UFC) sobre agar Preston modificado.

6. Los resultados se expresaron como la media del número de bacterias adheridas e invadiendo las células HEp-2, y el porcentaje de internalización dividiendo el número de bacterias resistentes al tratamiento con gentamicina entre el número total de bacterias adheridas, y el producto multiplicado por 100 (24).

Análisis estadístico:
Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de t de Student y el análisis de varianza de una vía (ONEWEY), con la base de datos Fox Por para Windows, versión 2.6.

Resultados

El número total de bacterias asociadas a las células HEp-2 (intra y extracelulares) para cada cepa de Campylobacter está registrada en la tabla 1. Los nueve aislados de Campylobacter sp. lograron adherirse e invadir esta línea celular.

Tabla 1. Adherencia e invasión de células Hep-2 por Campylobacter sp.

La media del número de bacterias al cual fue ajustado el inóculo de todas las cepas, para el experimento de adherencia e invasión, fue de 1,64 x 108 con una desviación estándar de 4,17 x 108.

La media del número de bacterias adheridas (intra y extracelulares) a las células HEp-2 de todos los aislados fue de 9,7 x 105 bacterias/ml, con una desviación estándar de 1,4 x 106. El 50% de las mismas estuvo por debajo de 3,5 x 105 bacterias/ml, y los valores mínimo y máximo observados fueron 1,8 x 104 y 4,2 x 106 bacterias/ml, respectivamente.

El análisis discriminado por grupo de estudio (diarrea y asintomático), arrojó los siguientes resultados: de las 5 cepas provenientes de los casos de diarrea se registró una media del número de bacterias adheridas de 1,3 x 106 bacterias/ml, y estos valores se desvían de la media de su grupo en 1,7 x 106 bacterias/ml. El 50% de las cepas mostró un porcentaje menor de 3,5 x 205 bacterias/ml, valor igual a la mediana del grupo total.

Al analizar la media del número de bacterias adheridas del grupo de cepas provenientes de niños asintomáticos, el valor fue de 1,7 x 105 bacterias/ml observándose una disminución marcada con respecto al grupo de cepas asociadas a diarrea. En relación a la cepa de referencia, la media de esta variable se asemejó a la media del grupo de cepas asociadas a diarrea (1,4 x 106 bacterias/ml y 1,3 x 105 bacterias/ml, respectivamente).

Con respecto al porcentaje de inóculo internalizado de todas las cepas (tabla 1), se obtuvo una media de 14,30%, con una desviación estándar de 15,29% y un valor mínimo y máximo de 3,46 y 50,49%, respectivamente.

Con respecto al número de bacterias que lograron invadir las células HEp-2, de las cepas aisladas de los niños con diarrea se obtuvo una media de 1,0 x 105 bacterias/ml, y en las cepas provenientes de niños asintomáticos de 8,6 x 105 bacterias/ml.

A pesar de que se observaron diferencias en las medias de número de bacterias adheridas e invadiendo las células HEp-2, de los dos grupos de cepas sometidas al estudio (diarrea y control), no se encontró diferencia estadísticamente significativa en las medias del número de bacterias adheridas e invadiendo las células HEp-2 de las cepas provenientes de ambos grupos de niños, al aplicar la prueba de t de Student.

Al comparar las medias del número de bacterias adheridas e invadiendo las células por especie (C. jejuni subsp. jejuni, C. coli y C. lari) y someterlas al análisis de varianza de una vía (ONEWAY), tampoco se encontró diferencia estadísticamente significativa entre el número de bacterias adheridas (F=0,7028, p=0,5318, NS) e invadiendo (F=0422, p=0,4088, NS) las células HEp-2 de las tres especies.

Aún cuando no se pudo comparar estadísticamente el grado de invasividad de la misma especie provenientes de diferentes cuadros clínicos, es de hacer notar la diferencia observada en la especie C. lari, entre las cepas D-184 proveniente de un cuadro tipo disentérico, la cual fue más invasiva que la D-282 procedente de un cuadro de diarrea secretora; este resultado contrasta con el resultado obtenido en la especie C. jejuni subsp. jejuni, cuyo porcentaje de internalización en el aislado del niño asintomático casi duplica al del aislado del niño con diarrea disentérica (C-22 y D-334, respectivamente).

Discusión

Aún no está claro si las variaciones encontradas en los signos y síntomas reportados en la EDA ocasionada por Campylobacter, resultan de diferencias en el huésped o debido a la cepa involucrada (11,13). Por otra parte, se sabe que no todas las personas expuestas a esta bacteria desarrollan la enfermedad (25). En un intento para tratar de explicar estas diferencias, en el presente estudio se investigó la presencia de dos factores de virulencia asociados a patógenos entéricos, como son la adherencia e invasión.

Los resultados del presente trabajo mostraron que todas las cepas probadas presentaron la capacidad de adherencia e invasión a las células HEp-2, con una diferencia no significativa entre los aislados provenientes de niños con diarrea y los aislados de niños asintomáticos. Este hallazgo difiere de los datos reportados por varios investigadores utilizando la misma línea celular (16, 17, 21), quienes encontraron correlación entre el cuadro clínico y la capacidad de adherencia e invasión de estos microorganismos, así como el bajo porcentaje de adherencia e invasión en los aislados provenientes de niños asintomáticos.

El grado de invasividad en los aislados provenientes de niños con EDA concuerdan con los datos de los aislamientos clínicos reportados por Konkel y Joens (19).

La presencia de portadores asintomáticos, cuyos aislados poseen la capacidad de adherirse e invadir células eucariotas, sugieren la participación activa de la respuesta inmune de estos niños. Varios estudios refieren que la inmunidad contra Campylobacter se adquiere como consecuencia de una o más infecciones. El desarrollo de inmunidad parece correlacionarse con el incremento de IgA en el suero humano (26-31). Por otra parte, Fauchére y col. (17) señalan que las bacterias pueden lograr adherirse e invadir la célula, con o sin consecuencia para la misma.

Aún cuando no se observó diferencia significativa en el grado de invasividad entre los grupos estudiados (diarrea y asintomáticos), diversos investigadores han descrito la síntesis de una citotoxina en cepas de Campylobacter, con efecto citotóxico sobre varias líneas celulares (32-36). Es posible que en el presente trabajo los aislados provenientes de niños con diarrea, además de invadir, produjeran esta citotoxina. Donennberg y col. (23) refieren que los organismos intracelulares que secretan citotoxinas pueden ser más virulentos.

A pesar de que no se pudo comparar estadísticamente el grupo de cepas aisladas de cuadros tipo disentérico con el aislado de diarrea secretora, aparentemente no se observó diferencia en la adherencia e invasión. Sin embargo, Everest y col. (37) reportaron una diferencia estadísticamente significativa entre los aislados de colitis y de diarrea secretora con respecto a la producción de la citotoxina.

Hasta ahora la mayoría de los estudios de patogenicidad los han realizado principalmente con las especies C. jejuni y C. coli (13, 15, 31, 38, 39). En 1987 quedó establecido el significado clínico de C. lari como patógeno entérico, de acuerdo a la detección de anticuerpos bactericidas en el suero de paciente con enteritis asociada a este microorganismo (40). En tal sentido, la diferencia no significativa en la capacidad de adherencia e invasión con respecto a las diferentes especies (C. jejuni subsp. jejuni, C. coli y C. lari) observada en este trabajo es de gran importancia, ya que se confirma que C. lari es un patógeno humano potencial, y se debe incluir en los estudios de patogenicidad de las campilobacterias termotolerantes.

Existen otros factores de virulencia a considerar en el estudio de la patogenicidad de Campylobacter, para tratar de esclarecer las diferencias clínicas y epidemiológicas observadas en la campilobacteriosis, y entre éstos destaca la síntesis de toxinas.

Conclusiones

1. No se observó diferencia estadísticamente significativa en la adherencia e invasión de los aislados provenientes de ambos grupos estudiados (diarrea y asintomáticos) ni entre los aislados de diarrea inflamatoria y secretora. La variación en las manifestaciones clínicas en estos pacientes y la presencia de portadores asintomáticos podría atribuirse a diferencias en el huésped; es decir, participación activa de la respuesta inmune, o al tipo de cepa involucrada, ya que se han descrito otros factores de virulencia en estos microorganismos.

2. No se observó diferencia estadísticamente significativa en la capacidad de adherencia e invasión entre las tres especies estudiadas (C jejuni subsp. jejuni, C. coli, y C. lari).

Recomendaciones

En vista de estos resultados, se sugiere realizar un estudio multifactorial que incluya aspectos epidemiológicos, factores de virulencia (adherencia, invasión, producción de toxinas) y análiis serológico de niños con EDA y niños asintomáticos, e incrementar el número de aislados en representación de cada caso, para el estudio de dichos factores.

De acuerdo a los resultados obtenidos, se confirma el potencial patógeno de C. lari en humanos, y se sugiere incluir esta especie en los estudios de patogenicidad de estos microorganismos.

Bibliografía:

1. Penner, J.: The Genus Campylobacter. A Decade of Progress. Clin. Microbiol. Rev., 1(2): 157-172, 1988.        [ Links ]

2. Penner, J.: Campylobacter, Helicobacter, and Related Spiral Bacteria. En: Balows, A.; Hausler, W.; Herrmann, K.; Isenberg, H. and Shadomy, H. Manual of Clinical Microbiology. 5a edition, American Society for Microbiology, Washington, DC., pp. 402-409, 1991.        [ Links ]

3. Urrestarazu, M.; Darricarrere, R.; Perez, M.; Daoud, G.; Serrano, N.; Cavazza, M. and Pérez-Schael, I.: Frequency of Campylobacter jejuni and other agents of acute diarrhea in venezuelan children. PAHO Bulletin, 21(3): 240-248, 1987.        [ Links ]

4. Urrestarazu,M.; Liprandi, F.; Pérez de Suárez, E.; González, R. and Pérez-Schael. I.: Características etiológicas, clínicas y sociodemográficas de la diarrea aguda en Venezuela. Rev. Panam. Salud Pública. 6(3): 149 - 156, 1999.        [ Links ]

5. Vizcaya, L.; Flores, A.; Hernández, J.; Nieves, B. and Pérez Schael, I.: Origen bacteriano de la enfermedad diarreica aguda en Mérida, Venezuela. Rev. Cub. Med. Trop. 51(1): 14 - 19, 1999.        [ Links ]

6. Velasco, J.; Vizcaya, L.; Nieves, B.; Pérez-Schael, I.; Flores, A.; Hernández, J. and Sánchez, K.: Campilobacterias termotolerantes como causa de Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) en niños merideños. Rev. Facultad de Farmacia. 42: 47-54, 2001.        [ Links ]

7. Torres, M.; Pirez, M.; Schelotto, F.; Varela, G.; Parodi, V.; Allende, F. y col.: Etilogy of children´s diarrhea in Montevideo, Uruguay: associated pathogens and unusual isolates. J. Clin. Microbiol. 39(6): 2134 -2139, 2001.

8. McIver, C.; Hansman, G.; White, P.; Doultree, J.; Catton, M. and Rawlinson, W.: Diagnosis of enteric pathogens in children with gastroenteritis. Pathology. 33(3): 353-358, 2001.        [ Links ]

9. Coker, A.; Isokpehi, R.; Thomas, B.; Amisu, K.; Obi, C.: Human campylobacteriosis in developing contries. Emerg. Infect. Dis. 8(3): 237-244, 2002.        [ Links ]

10. Reina, J.: Análisis de los mecanismos de patogenicidad y virulencia descritos en las campilobacterias termotolerantes. Enf. Infecc. Microbiol. Clin. 11 (9): 497-501, 1993.        [ Links ]

11. Konkel, M.; Monteville, M.; Rivera-Amil, V. and Joens, L.: The pathogenesis of Campylobacter jejuni-mediated enteritis. Curr. Issues. Intest Microbiol. 2(2): 55-71, 2001.        [ Links ]

12. Blaser, M. and Reller, B.:. Campylobacter enteritis. N. Engl. J. Med., 305: 1444-1452, 1981.        [ Links ]

13. Ruiz-Palacios, G.; Escamilla, E. and Torres, N.: Experimental Campylobacter diarrea in chickens. Infect. Immun. 34(1): 250-255, 1981.        [ Links ]

14. Kita, E.; Nishikawa, F.; Kamikaidou, N.; Nakano, A. and Kashiba, S.: Mononuclear cell response in the liver of mice infected with hepatotoxigenic Campylobacter jejuni. J. Med. Microbiol. 37: 326-331, 1992.        [ Links ]

15. Russel, R.; O´Donnoghue, M.; Blake, D.; Zulty, J. and DeTolla, L.: Early colonic damage and invasion of Campylobacter jejuni in experimentally challenged infant Macaca mulatta. J. Infect. Dis.168: 210-215, 1993.

16. Fauchére, J.; Rosenau, A.; Veron, M.; Moyen, E.; Richard, S. and Pfister, A.: Association with HeLa cells of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from human feces. Infect. Immun. 54(2): 283-287, 1986.        [ Links ]

17. Fauchére, J.; Kervella, M.; Rosenau, A.; Pagés, J. and Fendri, C.: In vitro of virulence factors of enteric Campylobacter spp. En: Nachamkin, I.; Blaser, M. and Tompkins, L. Campylobacter jejuni: current status and future trends. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, pp. 168-175, 1992.        [ Links ]

18. De Melo, M.; Gabbiani, G. and Pechére, J.: Cellular Events and intracellular survival of Campylobacter jejuni during infection of HEp-2 cells. Infect. Immun. 57 (7): 2214-2222, 1989.        [ Links ]

19. Konkel, M. and Joens, L.: Adhesion to and invasion of Hep-2 by Campylobacter spp. Infect. Immun. 57 (10): 2984-2990, 1989.        [ Links ]

20. Ruiz-Palacios, G.; Cervantes, L.; Newburg, D.; López-Vidal, Y. and Calva, J.: In vitro models for studying Campylobacter infections. En: Nachamkin, I.; Blaser, M.; Tompkins, L. Campylobacter jejuni: current status and future trends. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, pp. 176-183, 1992.        [ Links ]

21. Reina, J.; Muñoz, A.; Ros, M. and Fernández-Baca, V.: Presencia de factores de virulencia y patovariedades en cepas de Campylobacter jejuni aisladas en pacientes con diarrea y niños sanos. Enf. Infecc. Microbiol. Clin. 13: 511-515, 1995.        [ Links ]

22. Prasad, K.; Dhole, T. and Ayyagari, A.: Adherence, invasion and cytotoxin assay Campylobacter jejuni in HeLa and Hep-2 cells. J. Diarrhoeal Dis. Res. 14(4): 255-259, 1996.        [ Links ]

23. Donnenberg, M.; Donohue-Rolfe, A. and Keusch, G.: Epithelial cell invasion: An overlooked property of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) associated with the EPEC adherence factor. J. Infec. Dis. 160(3): 452-459, 1989.        [ Links ]

24. Russel, R. and Blake, D.: Cell association and invasion of Caco-2 cells by Campylobacter jejuni Infect. Immun. 62(9): 3773-3779, 1994.        [ Links ]

25. Black, R.; Levine, M.; Clements, M.; Huges, T.; Blaser, M: Experimental Campylobacter jejuni infections in humans. J. Infec. Dis. 157(3): 472-479, 1988.        [ Links ]

26. Glass, R.; Stoll, B.; Huw, M.; Struelens, M. and Kibriyi, A.: Epidemiology and clinical features of endemic Campylobacter jejuni infections in Bangladesh. J. Infec. Dis. 148 (23): 292-296, 1983.        [ Links ]

27. Blaser, M.; Black, R.; Duncan, D. and Amer, J.: Campylobacter jejuni - Specific Serum Antibodies Are Elevated in Healthy Banglandeshi Children. J. Clin. Microbiol., 21(2): 164-167, 1985.        [ Links ]

28. Blaser, M.; Taylor, D. and Echeverría, P.: Immune Response to Campylobacter jejuni in a rural community in Thailand. J. Infec. Dis.153(2): 249-254, 1986.        [ Links ]

29. Georges-Courbot, M.; Baya, C.; Beraud, A.; Maurier, D. and Georges, A.: Distribution and serotypes of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in enteric Campylobacter strain isolates from children in the Central African Republic. J. Clin. Microbiol. 23(3): 592-596, 1986.        [ Links ]

30. Figueroa, S.; Galeno, H.; Troncoso, M.; Toledo, S. and Soto, V.: Prospective Study of Campylobacter jejuni Infection in Chilean Infants Evaluated by Culture and Serology. J. Clin. Microbiol., 27(3): 1040-1044, 1989.        [ Links ]

31. Ruiz-Palacios, G.; Calva, J.; Pickering, L.; López-Vidal, Y.; Volkow, P.; Pezzarossi, H. and West, M.: Protection of breast-fed against Campylobacter diarrhea by antibodies in human milk. J. Pediatric. 116(6): 707-713, 1990.        [ Links ]

32. Yeen, W.; Puthucheary, S. and Pang, T.: Demostration of a citotoxin from Campylobacter jejuni. J. Clin. Pathol. 36(11): 1237-1240, 1983.        [ Links ]

33. Johnson, W. and Lior, H.: Toxins produced by Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Lancet. 28: 229-230, 1984.        [ Links ]

34. Johnson, W. and Lior, H.: Citotoxic and citotonic factors produced by Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and Campylobacter laridis . J. Clin. Microbiol. 24(2): 275-281, 1986.        [ Links ]

35. Mahajan, S. and Rodgers, F.: Isolation, Characterization and host-cell-binding properties of a cytotoxin from Campylobacter jejuni. J. Clin. Microbiol. 28(6): 1314-1320, 1990.        [ Links ]

36. Wassenaar, T. Toxin production by Campylobacter spp. Clin. Microbiol. Rev. 10(3): 466-476, 1997.        [ Links ]

37. Everest, H.; Goossens, H.; Butzler, J.; Lloyd, D.; Knutton, S. and Willians, P.: Differentiated Caco-2 cells as a models for enteric invasion by Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. J. Med. Microbiol. 37: 319-325, 1992.        [ Links ]

38. Lee, A.; O´rourke, J.; Barrigton, P. and Trust, T.: Mucus colonization as a determinant of pathogenicity in intestinal infection by Campylobacter jejuni: A mouse cecal model. Infect. Immun. 51(2): 536-546, 1986.

39. Lindblom, G.; Kaijser, B. and Sjögren, E.: Enterotoxin production and serogroup of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from patients with diarrhea and from healthy laying hens. J. Clin. Microbiol. 27(6): 1272-1276, 1989.        [ Links ]

40. Simor, A. and Wilcox, L.: Enteritis associated with Campylobacter laridis. J. Clin. Microbiol. 25(1): 10-12, 1987.        [ Links ]