Utilización del caldo de urea de Stuart para el test de la ureasa, como prueba en el diagnóstico de las levaduras.

Use of the Stuart urea broth for the urease test, like proof in the identification of yeasts .

Pérez, C.*; Goitía, K.*; Mata, S.*; Hartung, C.*; Colella, M. T.*; Reyes, H.*; Hernández, C.**; Villarroel, M.**; Ontiveros, J.***; Magaldy, S.* y Suárez, R.****
* Sección de Microbiología Médica. Instituto de Medicina Tropical, UCV.
** Sección de Bacteriología. Instituto de Medicina Tropical, UCV.
*** Sección de Epidemiología y Estadística, UCLA.
**** Instituto de Anatomía Patológica, UCV.

Resumen
    La prueba de la ureasa constituye una de las pruebas preliminares destinada al diagnóstico diferencial de las levaduras. para la misma se utiliza el medio de agar urea de Christensen, con la desventaja de que éste es un medio costoso y de compleja elaboración.

    El propósito de este estudio fue evaluar la utilidad del caldo urea de Stuart para realizar esta prueba, el cual es un medio ampliamente usado en el área de Bacteriología, y su elaboración es sencilla.

    Para tal fin, se estudió el comportamiento de 104 cepas de levaduras pertenecientes a los géneros Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon y Saccharomyces, en ambos medios. Los resultados no mostraron diferencia alguna entre el uso de los dos medios.

Abstract
    The urease test is one of the preliminary steps of the procedures recommended in the identification of yeasts from, clinical specimens. The culture media used for this purpose is the Christensen urea agar, which is laborious and expensive.

    The aim of our study was to compare the Christensen urea agar, which is a generally aid in the bacteriologic laboratory with the Stuart urease broth, a media less expensive and easy to prepare. The distribution of species of the 104 yeast evaluated included the following: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon and Saccharomyces. No difference were observed between the two media.

Palabras-clave: Levaduras, ureasa, caldo de urea de Stuart.

Introducción

    En las últimas décadas el estudio taxonómico de los hongos ha sido fundamental, debido al incremento de las infecciones oportunistas causadas por agentes micóticos, todo esto ocasionado por la epidemia del SIDA; al aumento de enfermedades neoplásicas, a las que se les administra corticoesteroides a altas dosis y de manera prolongada; y al uso de nuevos antimicrobianos de amplio espectro, siendo este aumento más importante en las infecciones producidas por las levaduras pertenecientes a los géneros Candida y Cryptococcus, las cuales causan una alta morbimortalidad (1-4).

    Para lograr el diagnóstico definitivo de estas levaduras, es importante primero conocer la procedencia de la muestra clínica, el procedimiento utilizado para su extracción, la manera del transporte de la misma, la epidemiología y los signos y síntomas que presenta el paciente.

    El reto comienza al tratar de aislar el posible agente causal de la micosis y lograr su identificación de la manera más certera posible. Es aquí donde el examen micológico juega un rol fundamental, destinado a determinar con la mayor precisión la identificación del mismo.

    Para tal fin, se utilizan procedimientos convencionales, como el examen en fresco de la muestra con KOH y tinta Parker o tinta china, para diferenciar las características microscópicas de la levadura en estudio, también se cultiva la muestra en el medio de Sabouraud, a temperatura ambiente y 37 °C; esto con el fin de conocer las características macroscópicas del hongo. Otros estudios que se realizan son los tendentes a evaluar la capacidad de la levadura de asimilar diversas fuentes de carbono y de nitrógeno, así como la habilidad de fermentar los carbohidratos. Existen en la actualidad procedimientos más avanzados, como son los métodos de Biología Molecular, por ejemplo la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), entre otros, los cuales son muy costosos en su realización (3, 5-7).

    En algunos casos es difícil realizar una identificación micológica apropia da cuando se trata de diferenciar levaduras del género Candida y Cryptococcus, sobre todo cuando se aíslan cepas de Cryptococcus, en las cuales no es posible observar la cápsula, la cual es el elemento más importante de diferenciación entre estos dos géneros; es aquí, donde las pruebas bioquímicas resultan de gran importancia, como es el caso de la "Prueba de la Ureasa".

    La urea constituye una fuente de nutrición nitrogenada utilizada por diversos microorganismos, los cuales producen una enzima (ureasa) que degrada a la misma contenida en el medio. Esta enzima ureasa cataliza la hidrólisis de la urea hasta obtener amonio y carbamato. El carbamato es hidrolizado de manera espontánea para originar ácido carbónico y una segunda molécula de amonio. A pH fisiológico, el ácido carbónico se disocia y las moléculas de amonio se unen con el agua, originando así un incremento del pH (8).

    Tomando en cuenta este principio, Rustigian y Stuart, en 1941 (9, 10), realizaron un valioso aporte en el campo de la taxonomía de las bacterias, introduciendo la prueba de la ureasa como una de las pruebas bioquímicas destinadas a la identificación de las mismas. El medio ideado por estos autores para realizar la prueba se componía de: extracto de levaduras 0,1 g, fosfato monopotásico 9,1 g, fosfato disódico 9,5 g, rojo de fenol 0,01 g, urea 20 g y agua destilada 1000 ml. De tal forma que la urea se utilizara como fuente nitrogenada y el rojo de fenol como un indicador del viraje de pH. Al sembrar en el medio un microorganismo que sea capaz de hidrolizar la urea, se desencadenará la descomposición de la misma en amonio, alcalinizando el medio y permitiendo el viraje del pH, produciendo un color rosado intenso que se difunde en el medio de cultivo (6, 11).

    Desde 1941 esta prueba se implementó como un parámetro importante para distinguir las bacterias del género Proteus de otras bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. También permitió la clasificación de las bacterias en aquéllas de hidrólisis rápida (a las 2 horas) y en otras de hidrólisis lenta (de 2 o más días) (9, 12 - 14).

    Para 1946 Christensen (15), elabora un medio en el cual disminuye la concentración de fosfato y lo enriquece con peptona y glucosa, en comparación con los constituyentes del medio de Stuart, lo que permitió acelerar el proceso de la hidrólisis de la urea y leer los resultados en 2 a 4 horas, obviando los falsos positivos. Este medio el cual recibió el nombre de Agar Urea de Christensen facilitó también el crecimiento de bacterias que no se desarrollaban en el medio de Stuart. La mayor desventaja de este medio constituye lo costoso y laborioso de su preparación (11, 15).

    Desde entonces la prueba de la hidrólisis de la urea ha representado un papel relevante, específicamente en la identificación de levaduras de importancia clínica como son las pertenecientes a los géneros de micetos no fermentadores como Cryptococcus, Rhodotorula y Trichosporon, los cuales son ureasa positivos; siendo útil para la diferenciación entre los géneros Cryptococcus y Candida, ya que este último es ureasa negativa (16).

    Seeliger, en 1956 (17), demuestra que las levaduras no hidrolizan la urea tan rápido como lo hacen las bacterias, siendo necesario un lapso entre 24 y 48 horas para poner en evidencia la reacción. También, este autor resaltó la importancia de la prueba de la ureasa, como prueba de identificación del género Cryptococcus.

    De acuerdo a lo descrito por Lodder en 1970, prácticamente todas las levaduras tienen alguna capacidad de utilizar la urea como fuente de nitrógeno, lo que se evidencia cuando la urea se encuentra en bajas concentraciones en el medio. Por otro lado, este autor hace la observación de que la prueba es realmente efectiva para diferenciar levaduras cuando el medio posee una elevada concentración de urea, como es en el caso del medio de Agar Urea de Christensen (6).

    Con el desarrollo de los múltiples métodos automatizados para la identificación de los hongos, la prueba de la ureasa ha sido incorporada a estas técnicas. Sin embargo, los métodos convencionales siguen teniendo importancia debido entre otras causas al elevado costo que implica la automatización y a la aparición de cepas patógenas cuyo comportamiento bioquímico o enzimático no es el habitual, lo cual conlleva a una identificación errónea del agente en estudio, tal es el caso, de 3 reportes en la literatura mundial, hasta la luz de nuestros conocimientos, de cepas de Cryptococcus neoformans ureasa negativa, que ameritaron la utilización de los estudios convencionales ya que la identificación automatizada fue errada. Dos de estos reportes, se trataban de aislamientos a partir de muestras clínicas de pacientes con SIDA, que cursaron con criptococosis diseminada (18 - 20).

    De esta manera, utilizando la prueba de la ureasa asociada a las diversas pruebas bioquímicas y los estudios morfológicos, se trata de obtener el mayor grado de precisión en la identificación de una levadura, especialmente en la actualidad debido al incremento cada vez mayor de infecciones micóticas.

    Por todo lo antes expuesto el propósito de nuestro trabajo fue evaluar la utilidad del Caldo Urea de Stuart para realizar la prueba de la ureasa como parte del diagnóstico micológico y demostrar su efectividad versus el medio de Agar Urea de Christensen, el cual es considerado el medio estándar universal para realizar esta prueba, tomando en cuenta que el primero es un medio de cultivo de fácil elaboración, económico y en consecuencia de utilidad en un laboratorio de escasos recursos, si se compara con el segundo, el cual es costoso, laborioso en su preparación y requiere de un personal especializado.

Materiales y Métodos

Cepas:
    Se estudiaron un total de 104 cepas de levaduras, de las cuales 49 pertenecían al género Candida, 42 cepas del género Cryptococcus, 8 del género Rhodotorula, 3 del género Trichosporon y 2 del género Saccharomyces, provenientes de la micoteca de la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical "Dr. Felix Pifano" de la Universidad Central de Venezuela (UCV), de las Secciones de Bacteriología y Micología de los Hospitales "Miguel Pérez Carreño", Hospital Universitario de Caracas y Hospital "Domingo Luciani". De las 49 cepas del género Candida, 5 eran Candida dubliniensis, donadas la Universidad de Texas, USA.

Cepas Control:
     Control positivo: Cryptococcus neoformans (WC 1400)
     Control negativo: Candida albicans (ATCC 90028)
    Procedentes de la Micoteca de la Sección de Micología Médica, Instituto de Medicina Tropical "Dr Felix Pifano".

Medios de Cultivos Utilizados:
    Agar Urea de Christensen: peptona 10 g, cloruro de sodio 5 g, rojo de fenol 0.012 g, agar 20 g, glucosa 1 g, urea Oxoid® amp 40% 20 g, agua destilada 1000 ml, pH final 6,8.
    Caldo Urea de Stuart: extracto de levadura 0,1 g, fosfato monopotásico 9,1 g, fosfato disódico 9,5 g, rojo de fenol 0,01 g, urea 20 g, agua destilada 1000 ml, pH final 6,8.

     Medio de Sabouraud: peptona 10 g, glucosa 20 g, agar 12 g, agua destilada 1000 ml.

     Medio de Sablac: peptona 10 g, glucosa 20 g, agar 12 g, leche 200 ml, agua destilada 800 ml.

Equipo para Identificación de Levaduras:
    Equipo automatizado marca Micro Scan® DADE BEHRING, con Paneles de Identificación Rápida de Levaduras.

Interpretación de Resultados:
    Color rosado intenso o rojo: Hidrólisis de la urea
    Color amarillo o rosado muy claro: Ausencia de hidrólisis de la urea

Método Estadístico:
     El método estadístico utilizado en este estudio fue el método porcentual descriptivo.

Metodología:

    Todas las cepas a estudiar, se sembraron en Sabouraud excepto el Cryptococcus que se sembró en Sablac; se colocaron en estufa a 37 °C por 48 horas. Luego, con ayuda del asa de platino, se arrastró suficiente cantidad de colonias; cada cepa se sembró en 2 tubos con el medio de Caldo Urea de Stuart y en 2 tubos con el Agar Urea de Christensen. Un tubo con cada uno de los medio se incubó en estufa a 37 °C y los 2 tubos restantes permanecieron a temperatura ambiente (24-28 °C).

    Los medios de cultivo se observaron diariamente, hasta que el medio de color amarillo viró al color rosado intenso o rojo, o en su defecto, hasta un máximo de 5 días.

    Las cepas de levaduras se sometieron a su identificación a través del método automatizado MicroScan ®, utilizando los Paneles de Identificación Rápida de Levaduras.

    Para la identificación de las cepas en estudio, se partió de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 37 °C en el medio de Sabouraud de las cepas pertenecientes a los géneros Candida, Rhodotorula, Trichosporon y Saccharomyces y en el medio de Sablac de las cepas del género Cryptococcus; se procedió a preparar un inóculo de cada cepa, mezclando suficiente material del cultivo arrastrado con el asa en 2 cc de agua destilada estéril, hasta obtener una densidad de 0,5 Mac Farland. Se distribuyó el inóculo a razón de 50 ml en cada uno de los pozos presentes en los Paneles de Identificación Rápida de Levaduras. Cada uno de estos paneles se selló con Parafilm y se colocaron en la estufa a 37 °C por 4 horas. Posteriormente, se introdujeron uno a uno en la bandeja de lectura del MicroScan® para la identificación de la especie.

Resultados

    De un total de 104 cepas de levaduras estudiadas, 49 pertenecían al género Candida: 26 C. albicans, 6 C. glabrata, 5 C. dubliniensis, 4 C. krusei, 4 C. lipolytica, 2 C. guilliermondii y 2 C. tropicalis; 42 cepas fueron Cryptococcus neoformans; 8 cepas de la especie Rhodotorula rubra; 3 de Trichosporon beigelii y 2 de Saccharomyces cerevisiae.

    El 100% de las cepas de Cryptococcus neoformans, Rhodotorula rubra, Trichosporon beigelii y Candida lipolytica, resultaron ureasa positiva. Esta respuesta a la prueba se observó de manera uniforme, tanto con el uso del Caldo Urea de Stuart como con el de Agar Urea de Christensen.Ver tabla 1.

 

Tabla 1. Actividad de la enzima ureasa de diferentes especies de levaduras, evaluada con dos medios de cultivo, a 37 °C y a temperatura ambiente.

 

    No se detectó actividad de la enzima ureasa en el 100% de las cepas pertenecientes a las especies de C. albicans, C. dubliniensis, C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis y Saccharomyces cerevisiae, reportándose como ureasa negativa.

    Es de hacer notar que las cepas ureasa negativa en el Caldo Urea de Stuart no hubo cambios en relación al color en el medio, en contraste con lo observado en el medio de Agar Urea de Christensen en el cual se evidenciaron leves cambios de color a nivel del bisel de amarillo a un rosado muy claro. Sin embargo esto se interpretó como ureasa negativa, al compararse este resultado con lo obtenido con las cepas de control (tabla 1).

    En las 57 cepas pertenecientes a las especies en las que se observó hidrólisis de la urea, la reacción fue evidenciada por ambos métodos implementados (Caldo Urea de Stuart y Agar Urea de Christensen), tanto a 37 °C como a temperatura ambiente (tabla 2).

 

Tabla 2. Compraración de la prueba de la ureasa con el medio de Christiansen y el medio Stuart

 

    Al evaluar el tiempo transcurrido en el cual se hace evidente la hidrólisis de la urea, se observó que el cambio de color de amarillo a rosado intenso en ambos medios de cultivo, fue apreciado entre las 24 y 48 horas de observación, con un fuerte predominio a las 24 horas, especialmente en las pruebas cuyos medios fueron conservados en estufa a 37 °C. No se observó cambio del color del medio después del segundo día (tabla 3). 

 

Tabla 3. Relación entre el tiempo transcurrido para la observación de la hidrólosis, utilizando los dos medios de cultivo, a 37 °C y a temperatura ambiente.

 

Discusión

    El papel fundamental del examen micológico de una muestra clínica determinada, es la identificación adecuada del hongo, lo que permitirá implementar un tratamiento efectivo de la micosis a precisar. Para tal fin, es importante efectuar el estudio morfológico, bioquímico y enzimático específico de la cepa a evaluar.

    El medio Agar Urea de Christensen (8) ha sido empleado por cerca de 56 años para el reconocimiento de los microorganismos productores de ureasa, permitiendo la diferenciación de varios géneros y especies, incluyendo la diferenciación de levaduras del género Cryptococcus de las del género Candida.

    Desafortunadamente, el mismo posee desventajas, como son su elevado costo y su compleja elaboración, que requiere de un personal técnico altamente capacitado, lo cual lo hace un medio poco accesible a un laboratorio de modestos recursos.

    El presente trabajo evalúa el comportamiento de la prueba de la ureasa utilizando el medio de Caldo Urea de Stuart, el cual es más económico, más fácil de elaborar y ha sido utilizado hace 57 años en el área de bacteriología.

    Nuestros resultados indican que el 100% de las cepas estudiadas [Candida albicans (26), C. glabrata (6), C. dubliniensis (5), C. krusei (4), C. lipolytica (4), C. guilliermondii (2), C. tropicalis (2); Cryptococcus neoformans (42); Rhodotorula rubra (8); Trichosporon beigelii (3) y Saccharomyces cerevisiae (2)], se comportaron de manera similar al utilizar ambos métodos, demostrando así la efectividad del Caldo Urea de Stuart para realizar la prueba de la ureasa en un laboratorio de micología clínica.

    Es de hacer notar en nuestro estudio que algunas veces se observó, a nivel de la superficie del bisel en el medio Agar Urea de Christensen, un cambio de color de amarillo a un rosado muy claro, producido por algunas cepas evaluadas ureasa negativas, dentro de las primeras 24 horas. Este fenómeno no debe de confundir al micólogo y debe reportarse como negativo, debido a que para considerar una prueba de la ureasa positiva debe presentarse un cambio del color del medio de cultivo de amarillo a un rosado intenso a fucsia. Este ligero cambio de color se explica a través de lo referido por Lodder (1970), cuando expresa textualmente, que "prácticamente todas las levaduras pueden utilizar la urea en bajas concentraciones" y esto se observa a nivel del bisel, ya que es la zona más delgada del medio de cultivo. De la misma manera, según Koneman esta observación es a consecuencia de la alcalinización del medio por la hidrólisis de pequeñas cantidades de urea, acompañado de un fenómeno de formación de aminas procedentes de la reacción de descarboxilación oxidativa de los aminoácidos en la superficie del bisel expuesta al aire (6,11,13). Todo lo antes mencionado, resalta la importancia de tener las cepas de control adecuadas siempre que se realice la prueba de la ureasa, debiendo utilizarse una cepa conocida de Cryptococcus neoformans como cepa de control ureasa positiva y una cepa de Candida albicans como cepa de control ureasa negativa (6,21).

    Vale la pena resaltar la importancia del tamaño del inóculo a la hora de realizar la prueba de la ureasa, el cual debe de ser adecuado (3 asadas sobre el cultivo a estudiar); factor este que favorece la lectura de la misma a las 24 horas de observación (11,22).

    En el presente trabajo la respuesta de la Candida dubliniensis ante la prueba de la ureasa, fue la misma que la observada para Candida albicans, por lo que dicha prueba no contribuye a diferenciarlas (23,24).

    Estos resultados no se pueden comparar con otro estudio investigado en la literatura, hasta la luz de nuestros conocimientos, debido a que no existe otro similar en donde se haya comparado ambos métodos.

    Aunque reconocemos que el número de cepas por cada una de las especies de levaduras estudiadas no es realmente representativo de un universo, es de hacer notar que hubo concordancia entre los resultados obtenidos al implementar el test de la ureasa con el Caldo Urea de Stuart en comparación con el Agar Urea de Christensen el cual es el medio patrón estándar, utilizado ampliamente en los laboratorios de bacteriología y de micología a nivel mundial. Por consiguiente, nosotros concluimos que el Caldo Urea de Stuart se puede utilizar como una opción en la prueba de la ureasa en laboratorios de micología, especialmente en aquellos en los cuales los recursos económicos sean muy limitados.

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