Identificación molecular de micobacterias del complejo tuberculoso: Estandarización de un método de PCR basado en secuencias conservadas de la región espaciadora 16S-23S del operón de ADN ribosomal.

Molecular identification of micobacteria in the tuberculous complex: Standarization of a PCR method based on conserved sequences of the 16S-23S spacing region in the ribosomal DNA operon.

Pérez I**, Mendoza G**, Hernández C*, Muñoz F*, Gómez M*, González S*.

* Sección de Bacteriología del Instituto de Medicina Tropical (IMT), UCV.

** Estudiantes de la Escuela de Bioanálisis, UCV.

Trabajo presentado en las XXVIII Jornadas Venezolanas de Microbiología "Dr. Rafael Bonfante Garrido", Barquisimeto, Venezuela, del 7 al 9 de noviembre de 2002.

Premio "Sociedad Venezolana de Microbiología para Estudiantes", otorgado por la Sociedad Venezolana de Microbiología.

ABSTRACT

    In order to improve the diagnosis of tuberculosis, a methodology to identify mycobacteria belonging to the tuberculosis complex has been designed, based in sequence comparison of the 16S-23S region of the ribosomal DNA operon from 30 mycobacterial species. The method uses a combination of Polymerase Chain Reaction (PCR) with four primers (TTS, SS2, S1A and S1B), and digestion by restriction enzymes NheI and MscI. The technic was standarized using six mycobacterial isolates (M. tuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum, M. smegmatis, M. marinum, M. terrae), obtaining amplification and digestion in all cases.

    We conclude that the combination of PCR and digestion with restriction enzymes, represent a fast, simple, sensitive and specific method for identification of mycobacteria belonging to the tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis and M. africanum). However it is important to consider few recommendations to help decrease the unspecific amplification problems that appear during the study. One of the most important is the use of TTS-SS2 amplicon only as control for the presence and integrity of the bacterial DNA, and the combination of PCR and Nhe1 digestion only in the TTS-S1B fragment.

RESUMEN

    Con la finalidad de mejorar el diagnóstico de la tuberculosis, y basados en el estudio de la secuencia de la región espaciadora 16S-23S del operón de ADN ribosomal de treinta especies de micobacterias, se diseñó un método de identificación de micobacterias pertenecientes al complejo tuberculoso utilizando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en combinación con enzimas de restricción. Para ello se diseñaron cuatro primers (TTS, SS2, S1A, S1B) y se emplearon las enzimas NheI y MscI. Se estandarizó la técnica de PCR y digestión enzimática, utilizando seis aislados micobacterianos (M. tuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum, M. smegmatis, M. marinum y M. terrae), lográndose la amplificación con los primers diseñados y digestión enzimática para cada una de las micobacterias.

    Podemos concluir que la PCR, en combinación con el uso de enzimas de restricción, constituye un método rápido, sencillo, sensible y específico para la identificación de especies micobacterianas pertenecientes al complejo tuberculoso (M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis). Sin embargo, es importante tener en cuenta algunas recomendaciones que reducirán los problemas de especificidad y falsos positivos obtenidos durante el estudio. Una de ellas sería la utilización del fragmento TTS-SS2 en el PCR sólo como control de la presencia e integridad del ADN bacteriano, y el PCR en combinación con la digestión con NheI solamente en el fragmento TTS-S1B.

Palabras-clave: Micobacterias, tuberculosis, ADN, Mycobacterium tuberculosis.

INTRODUCCIÓN

    El reciente resurgimiento a nivel mundial de la tuberculosis, se atribuye a varias causas, que incluyen el abandono de la terapia antimicrobiana, el surgimiento de cepas resistentes a múltiples antibióticos y las limitaciones y dificultades de los métodos diagnósticos.

    El organismo causante de este gran problema de salud es el bacilo Mycobacterium tuberculosis, perteneciente al género Mycobacterium. Se han descrito por lo menos 41 especies de micobacterias, pero el 95% de las infecciones humanas son causadas por seis especies: M. tuberculosis, M. kansasii, M. avium- intracellulare, M. fortuitum, M. chelonae y M. leprae. Entre ellas, la más importante es la tuberculosis, infección que puede afectar cualquier órgano, aunque generalmente se limita a los pulmones ⁽¹⁰⁾.

    Aún cuando la tuberculosis es tratable (puede ser curada), la susceptibilidad a los antibióticos difiere entre cada una de las especies de micobacterias, de allí la importancia del diagnóstico diferencial en el contexto de la aplicación de terapia antimicrobiana ⁽⁹⁾.

    El diagnóstico diferencial de la tuberculosis es difícil, puesto que desde el punto de vista tanto clínico como microscópico (basado en la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen), es indistinguible de otros agentes que pueden causar una infección pulmonar o diseminada ^{(2, 9, 10, 14)}. Además las técnicas tradicionales que se emplean para la identificación de micobacterias, basadas en medios de cultivo y pruebas bioquímicas, tardan alrededor de ocho semanas o más en dar un diagnóstico definitivo del agente micobacteriano presente en la muestra.

    Con lo anteriormente expuesto, se hace clara la necesidad de un método rápido que permita identificar la especie micobacteriana involucrada. Una buena alternativa la constituyen los métodos de diagnóstico basados en técnicas de biología molecular, específicamente el método de la PCR, el cual representa una técnica de gran ayuda en diagnóstico, debido a su alta especificidad y rapidez. De hecho, en los últimos años se han venido realizando variedad de estudios del uso de la PCR para la identificación de micobacterias. Sin embargo, la mayoría de las secuencias utilizadas como blanco (ej. hsp65, mtp40, IS6110) no permiten la identificación definitiva de la especie de micobacteria ^(1,5,7,13), por lo que se ha hecho necesaria la búsqueda de una mejor alternativa mediante el estudio de una secuencia blanco que permita una mayor especificidad y rapidez para el diagnóstico de M. tuberculosis. Un ejemplo lo constituye el operón de ADNr, el cual está integrado por tres genes: 16S, 23S y 5S, los cuales codifican las tres especies de ARN que forman el ribosoma. Este operón se encuentra en todas las bacterias, por lo que sería ideal como blanco diagnóstico; sin embargo, debido a que el operón contiene secuencias altamente conservadas, se dificulta la diferenciación entre especies bacterianas ^{(6, 8)}.

    En un trabajo previo se analizó la región espaciadora 16S-23S del operón ADNr de treinta especies de micobaterias, encontrándose que cada especie posee un tamaño característico, el cual varía entre 255 y 363 pb. En todas las micobacterias estudiadas se identificaron secuencias altamente conservadas denominadas SAC-1 y SAC-2, con un tamaño de 27 pb y 49 pb, respectivamente. Considerando que el alto grado de conservación de esta secuencia no se observa en otras bacterias analizadas, se pensó en la posibilidad de utilizarlas para la diferenciación de micobacterias de otras bacterias ⁽⁴⁾.

    Este trabajo, tiene como finalidad diseñar y estandarizar un método de PCR-digestión enzimática, que permita la identificación de micobacterias del complejo tuberculoso, utilizando como blanco secuencias conservadas de la región espaciadora 16S-23S del operón de ADNr de micobacterias.

MATERIALES Y MÉTODOS

    1. Población y muestra: Para este estudio se utilizaron siete cepas de micobacterias (M. fortuitum, M. kansasii, M. marinum, M. phlei, M. smegmatis, M. terrae y M. tuberculosis), aisladas de muestras clínicas, de pacientes que acudieron a los servicios de la Sección de Bacteriología del Instituto de Medicina Tropical (IMT). Dichas cepas, previamente identificadas mediante métodos tradicionales, fueron aisladas en los siguientes medios de cultivo: Lowestein-Jensen, Agar Middlebrook 7H11, Caldo Middlebrook 7H9, Dubos Broth Base.

    2. Aislamiento de ADN: Para obtener el ADN genómico de las micobacterias se ensayaron tres métodos de aislamiento: Trizol (GIBCOBRL^® Cat. N° 15596-026), cloruro de guanidino⁽³⁾ y el método de solución isotónica, en el cual las células obtenidas de 5 ml de cultivo se lisan en buffer de homogeneización (0,3M Tris pH 8.0, 0,1M NaCl, 6mM EDTA) con perlas de vidrio de 0,4-0,5 mm, por 2 min. a baja velocidad. El material resultante se extrae con fenol: cloroformo (1:1) y se precipita a -20°C toda la noche con acetato de sodio (3M pH 5,0) en un volumen 1/10 y dos volúmenes de etanol 100%. El ADN obtenido se lava con etanol 70%, se deja secar y se resuspende en 50 µl de buffer TE (10mM Tris/HCl pH 7,4; 1mM EDTA pH 8,0).

    3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Luego de obtener el ADN de cada una de las micobacterias empleadas se les realizó la PCR con tres combinaciones de cuatro primers diseñados, denominados TTS (5'-TGCCAAGG-CATCCACC-3'), SS2 (5'-AGTCGTA-ACAAGGTAGCCG-3'), S1A (5'-CCTCAGGACCCAACAGTGTG-3') y S1B (5'-TGGATAGTGGTTGCC-GAGC-3').

    Se emplearon controles positivos para la PCR: plásmido pBL1 con los primers sgr13 (5'-CACGTGCACC-GAGGTCCACGATGTATT-3') y sgr11 (5'-AAGCGTAGACCCAGTT-TCCCAGGCTTATCC-3'), y como controles positivos de la muestra se usaron los mismos primers (sgr13-sgr 11) con el ADN de cada una de las micobacterias estudiadas. Como controles negativos se sustituyó el ADN de cada especie por el mismo volumen de agua, y también se usaron cepas de nocardias (N. asteroides, N. brasiliensis y N. caviae), aisladas a partir de muestras clínicas, de pacientes.

    Los volúmenes y las concentraciones finales de la reacción de la PCR que empleamos como base para las estandarizaciones fueron las recomendadas por el boletín técnico de la PCR Core System de PROMEGA^®, donde se establecen las siguientes pautas: Solución de MgCl2 (1,5mM), Buffer de reacción (50mM KCl, 10mM Tris-HCl pH 9,0; 0,1% Triton), mezcla de nucleótidos (200mM cada uno), Primer 1 (0,1-1,0 µM), Primer 2 (0,1-1,0 µM), Taq polimerasa (1,25U/50µl), ADN patrón (menos de 0,5µg/50µl) y completar con agua hasta un volumen final de 50 µl.

    Las condiciones iniciales de amplificación del ADN en el termociclador automatizado (GENE-CYCLER de BIO-RAD^®), las cuales habían sido previamente utilizada en el laboratorio con éxito, están descritas en la tabla 1.

Tabla 1. Condiciones generales de amplificación del ADN en el termociclador automatizado (GENE-CYCLER de BIO-RAD^®).

    Es muy importante destacar que todas las variables y condiciones de partida fueron estandarizadas para llegar a la optimización de nuestro ensayo (ver resultados).

    4. Digestión enzimática: Luego se aplicó la técnica de digestión enzimática a los tres fragmentos amplificados por PCR de cada una de las micobacterias. Para la enzima NheI (GIBCO BRL^®) se utilizó 5U de enzima para cada 10µl de ADN (concentración variable), en buffer de reacción (20mM Tris/HCl pH 7,4; 5mM MgCl₂ y 50mM KCl) en un volumen final de 20µl. Para la enzima MscI (GIBCO BRL^®) se emplearon 2,5U de enzima en su buffer de reacción (50mM Tris/HCl pH 8,0; 10mM MgCl₂ y 50mM NaCl). La digestión se llevó a cabo a 37°C por un tiempo de al menos 60 min.

    5. Visualización y análisis de resultados: Tanto los fragmentos obtenidos por PCR, como los productos de digestión enzimática, se corrieron electroforéticamente en una cámara de tipo vertical, utilizando como buffer de corrida TAE (40mM Tris/ Acetato pH 7,7 y 1mM EDTA), y aplicando 100 V y 200 A. Se emplearon dos tipos de agarosa:

    Agarosa (Invitrogen® Cat. N° 15510-027) en concentraciones de 0,9-1,5% en buffer TAE conteniendo 1,0 µg/µl de bromuro de etidio.

    Agarosa 1000 (GIBCO BRL^® Cat. N° 10975-035): Se utilizó para la separación de de productos de PCR y otros fragmentos pequeños de ADN por su alta resolución. Se trabajo con una concentración de 4,5% en buffer TAE conteniendo 1,0 µg/µl de bromuro de etidio.

    En ambos casos, para la corrida de las muestras se utilizó el buffer "Loading" (50% v/v glicerol, 0,2M EDTA pH 8,3 y 0,05% p/v de azul de bromofenol) en una relación ¼. Para el análisis de las bandas correspondientes a los fragmentos de ADN se utilizaron dos patrones de peso molecular: λ-Hind III (10mg por bolsillo) y 100 bp ADN Ladder (~17µg por bolsillo). La visualización de los fragmentos de ADN se hizo bajo luz ultravioleta. Las fotografías de los geles se realizaron con una cámara digital Kodak DC290 ZOOM en combinación con el software de análisis de imagen Kodak 1D, versión 3.5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Estandarización del método: 

    1.1- Protocolo de aislamiento de ADN. Se ensayaron tres métodos para el aislamiento de ADN de micobacterias (Trizol^®, cloruro de guanidino y solución isotónica), que difieren primordialmente en el mecanismo de ruptura celular utilizado y la cantidad de cultivo empleado: en el método de solución isotónica se emplean las células precipitadas a partir de 5 ml de cultivo, mientras que en el método de Trizol® se utiliza una asada del cultivo y en el de cloruro de guanidino células precipitadas a partir de 1,5 ml del cultivo. Sin embargo, no podemos afirmar que esto fue determinante en la obtención de los resultados, ya que cada uno de los métodos ha sido empleado en otros laboratorios de manera satisfactoria.

    Con el método de Trizol® nunca se evidenció la obtención de ADN en corrida electroforética, lo cual puede atribuirse a que existiera una insuficiente ruptura celular. Lo contrario ocurrió con la técnica de cloruro de guanidino, donde sí se evidenció ADN al realizar la corrida electroforética. Sin embargo, no hubo amplificación de ese ADN por PCR; esto pudo deberse a la perdida de la integridad del ADN o interferencia química con la Taq polimerasa (presencia de inhibidores). A pesar de que en el método de ruptura celular con solución isotónica el efecto mecánico es más fuerte, lo cual hace más probable el daño físico a la molécula de ADN, la amplificación ocurrió de manera exitosa.

    De los tres métodos se escogió el de ruptura por método mecánico en solución isotónica, por ser el que produce mayor cantidad de ADN, además de ser amplificable (ver figura 1).

Figura 1. PCR de ADN de micobacterias (aislados por el método de solución isotónica) con los primers controles sgr 13-sgr 11.

    1.2.- Condiciones de la PCR. Se utilizaron tres combinaciones de primers. El primer par de primer se denomina TTS-SS2, ubicándose en el extremo 3´ del gen 16S y en el extremo 5´ del gen 23S, respectivamente. Como estos genes se encuentran altamente conservados en todas las bacterias, son usados como controles positivos para el ADN aislado. La segunda combinación está integrada por un primer ubicado en el extremo 3´ del gen 16S (SS2) y otro en la región espaciadora, específicamente en la región SAC-1, denominado S1A. Este par permite amplificar un producto específico para micobacterias. Lo mismo ocurre con la tercera combinación de primers, donde uno de ellos denominado S1B se ubica en la región SAC-2 del espaciador y el otro en el extremo 5´ del gen 23S (TTS) (ver figura 2).

Figura 2. Esquema que muestra la ubicación y producto de amplificación de cada par de primers diseñado para las micobacterias.

    Se tomó como punto de partida las concentraciones sugeridas en el protocolo para la PCR de la casa comercial PCR Core System, tal como se específica en materiales y métodos. A partir de allí se debieron realizar estandarizaciones de los siguientes componentes: ADN, Taq polimerasa, MgCl2 y primers, estableciéndose finalmente las siguientes condiciones óptimas de reacción: solución MgCl2: 2mM; buffer de reacción: 20mM Tris/HCl, pH 8,4; 50mM KCl; mezcla de nucleótidos: 10 µM cada uno; Primers: 1,0 µM de cada uno; Taq polimerasa: 1 unidad; ADN patrón: 0,5 µg/50 µl; y agua libre de nucleasas hasta completar un volumen final de 50 µl.

    De manera similar el programa de amplificación fue estandarizado tomando como base las temperaturas de hibridización de cada primer (TTS 64,9°C, SS2 67,6°C, S1A 72°C y S1B 66,8°C), partiendo de las condiciones estándar de la PCR (11) y de ensayos previos en el laboratorio. Por lo tanto se inicio el estudio con programa de amplificación detallado en la tabla 2.

Tabla 2.

    Se ensayaron varias temperaturas de hibridización (60, 50, 52 y 45°C) y, aunque teóricamente se esperaba que mientras más lejos estuviese la temperatura de hibridización del programa con respecto a la del primer, se observara mayor inespecificidad de la amplificación. Esto no ocurrió con nuestros resultados. Se decidió emplear la temperatura de hibridización de 45°C, con la cual se observó menor amplificación inespecífica y resultados reproducibles a lo largo de todo el trabajo.

    Finalmente se estableció el siguiente como óptimo el programa de amplificación reseñado en la tabla 3.

Tabla 3.

    1.3.- Corrida electroforética. Para obtener una óptima visualización de los productos de la PCR y la digestión enzimática, se utilizaron geles de agarosa a diferentes concentraciones. Luego de varios ensayos, se decidió emplear geles de agarosa al 1,0%, para la observación del ADN genómico luego de la extracción, al 1,0-1,5% para evidenciar los fragmentos de ADN amplificados por PCR, así como también los productos de la digestión enzimática del fragmento TTS-SS2 y, al 4,5% de agarosa 1000 para los fragmentos de ADN TTS-S1B y SS2-S1A digeridos después de la restricción con las endonucleasas.

    En la corrida electroforética, el tiempo empleado fue entre 40 minutos a 1½ hora en el caso de los geles de agarosa de 0,9-1,5%. Cuando estos geles se corrían por períodos de más de 1½ hora las bandas de bajo peso molecular <500pb son imposibles de visualizar, por lo cual se decidió utilizar tiempos <1½ hora. En el caso de los geles de agarosa 1000 de 4,5% se empleó un tiempo de corrida de 2 horas, y no se observó el inconveniente anteriormente mencionado.

2. Resultados del ensayo de PCR: La amplificación realizada con los tres pares de primers (TTS-SS2, TTS-S1B, SS2-S1A) para cada una de las micobacterias (M. fortuitum, M. kasasii, M. smegmatis, M. terrae, M. tuberculosis), produjeron en cada caso los productos de amplificación correspondientes a los tamaños esperados (ver cuadro 1 y figuras 3 y 4). La excepción fue la cepa identificada como M. phlei, en la cual el tamaño de los fragmentos amplificados difiere del tamaño esperado, de acuerdo a las secuencias de la región espaciadora publicada por GENEBANK. El tamaño obtenido de cada uno de los amplicones en este caso fue el siguiente: 550 pb con TTS-SS2, 180 pb con TTS-S1B y 250 pb con SS2-S1A (ver figura 5). Es importante destacar que tanto los controles positivos como los negativos arrojaron los resultados previstos en cada uno de estos ensayos, lo cual valida los resultados obtenidos.

Cuadro 1. Tamaño esperado (pares de base) de los fragmentos amplificados con las diferentes combinaciones de primers diseñadas, para cada una de las micobacterias estudiadas en base a la secuencia publicada en GENEBANK.

Figura 3. PCR con ADN de M. tuberculosis.

Figura 4. PCR con ADN de M. smegmatis.

Figura 5. PCR de ADN de M. phlei.

    Las bacterias empleadas como controles negativos (N. asteroides, N. brasiliensis y N. caviae) fueron amplificadas con el par de primers TTS-SS2, obteniéndose fragmentos de aproximadamente 500, 450 y 300 pb, respectivamente, tal y como se esperaba. Con el par SS2-S1A, a pesar de que se esperaba que el primer S1A debería ser específico para micobacterias, se obtuvo amplificación para las nocardia, produciéndose fragmentos muy similares entre sí, de un tamaño aproximado de 230 pb. Es importante resaltar que con el par de primers específico TTS-S1B no hubo amplificación con ninguno de los ADN de las cepas controles de nocardias (ver figura 6). Se debe mencionar el hecho de que las secuencias de las regiones espaciadoras 16S-23S de estas bacterias no se conocen o no se han publicado, por lo que no se podía predecir la especificidad en este género.

Figura 6. PCR con ADN de nocardias.

    3. Resultados de la digestión enzimática: Se analizó el mapa de restricción de las regiones espaciadoras 16S-23S de treinta especies de micobacterias. Se encontró que en micobacterias pertenecientes al complejo tuberculosis existen sitios de corte específicos para las enzimas de restricción MscI y NheI, las cuales se ubican entre el gen 16S y la región SAC-1 y entre la región SAC-2 y el gen 23S, respectivamente. Estos sitios de corte no se encuentran en micobacterias no tuberculosas, por lo cual podría servir como herramienta para la diferenciación de micobacterias tuberculosas.

    Luego de realizar la amplificación por el método de la PCR para cada una de las micobacterias estudiadas, se procedió a realizar la digestión con enzimas de restricción, tanto del fragmento TTS-SS2 (con ambas enzimas NheI y MscI), como de los fragmentos TTS-S1B (solo con NheI) y SS2-S1A (sólo con MscI).

    En el caso de M. tuberculosis, se obtuvieron los resultados esperados luego de la digestión enzimática para cada uno de los fragmentos amplificados (ver figuras 7 y 8).

Figura 7. Esquema del patrón de amplificación y digestión enzimática de los fragmentos de ADN esperados para M. tuberculosis con los tres pares de primers diseñados y las dos enzimas de restricción empleadas.

Figura 8. Separación electroforética en gel de agarosa 1000- 4,5%, de los fragmentos de ADN de M. phlei (A), M. smegmatis (B), M. tuberculosis (C) digeridos con enzimas de restricción.

    Los resultados obtenidos para las micobacterias no pertenecientes al complejo tuberculosis se describen a continuación:

    Para M. smegmatis la digestión de los productos o fragmentos TTS-S1B y SS2-S1A no mostraron corte con ninguna de las dos enzimas (ver figura 8). Sin embargo, cuando la digestión enzimática se realiza al fragmento TTS-SS2 con la enzima MscI se obtienen dos fragmentos, uno de 231 pb y otro de 224 pb. Esto se debe a que existe un sitio de corte para la enzima, en la región espaciadora 16S-23S de operón de ADNr; pero, a diferencia de lo que se observa en el complejo tuberculosis, este sitio de corte está ubicado entre los 87 pb que separan a los sitios de unión de los primers S1A y S1B.

    En cuanto a las restantes micobacterias no tuberculosas (M. fortuitum, M. kansasii, M. marinum y M. terrae) no mostraron corte enzimático con ninguno de los tres fragmentos obtenidos.

    En el caso de los fragmentos amplificados (SS2-S1A) de los controles negativos (nocardias), se les realizó digestión enzimática con la enzima MscI, no observándose ningún corte en el fragmento indicado.

    Merece una mención especial el resultado obtenido para la supuesta cepa de M. phlei donde se observó digestión enzimática con MscI, tanto en el fragmento TTS-SS2 como en el fragmento SS2-S1A (ver figura 8). Sin embargo, no sucedió lo mismo con el otro fragmento específico que amplifica con TTS-S1B (ver figura 8). Estos resultados sugieren que existe un sitio de corte para la enzima MscI, el cual se encuentra ubicado en las secuencias pertenecientes al fragmento que amplifica SS2-S1A. Al analizar las secuencias publicadas (GENEBANK) de la región espaciadora de M. phlei no se observó este sitio de corte.

    Al encontrar esta discrepancia, ya no sólo en el tamaño de los productos de la PCR sino también en el paso de digestión enzimática, decidimos secuenciar el ADN de la supuesta cepa M.phlei. Para ello se utilizó el fragmento de amplificación TTS-SS2, ya que éste debería abarcar toda la región espaciadora 16S-23S. El objetivo era verificar si existía una homología o no con el ADN de una micobacteria diferente a M. phlei o si dicha cepa se encontraba contaminada con otro microorganismo. No obstante los resultados de esta primera secuenciación no fueron concluyentes, puesto que no se encontró homología con la secuencia de M. phlei. Tampoco se pudo identificar a qué micobacteria pertenecía el ADN, ya que no mostraba homología con ninguna secuencia publicada en GENEBANK. En los actuales momentos se está analizando nuevamente y en mayor detalle este problema. Es importante enfatizar que nuestra técnica permitió detectar de forma inmediata esta incongruencia con respecto a los resultados previos.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

    Podemos concluir que, mediante la combinación de la técnica de la PCR de secuencias blancos de la región espaciadora 16S-23S del operón de ADNr, con la digestión enzimática de los productos, es posible identificar rápidamente si un aislamiento es de origen micobacteriano, y si la micobacteria pertenece o no al complejo tuberculoso.

    La técnica de PCR, basada en la amplificación de secuencias de la región espaciadora, representa un importante contribución y muestra varias ventajas: en primer lugar, podemos decir que la PCR, en combinación con el uso de enzimas de restricción, constituye un método rápido, ya que permite determinar en 72 horas si una micobacteria (previamente aislada) pertenece o no al complejo tuberculoso. El método es sencillo, puesto que una vez que el operador adquiere la habilidad y destreza de la técnica en general (en cuanto a la realización de cálculos, preparación de soluciones a emplear en una mezcla de reacción y preparación de geles para una corrida electroforética) es fácil de implementar. Además, el método mostró una alta sensibilidad, puesto que se obtuvo amplificación con los ADN de todas las micobacterias ensayadas, y demostró también ser específico, puesto que con el par de primers TTS-S1B sólo se observó amplificación en el caso de micobacterias. Aún más, la digestión enzimática de los productos de la PCR permitió la identificación de micobacterias del complejo tuberculosis, y su diferenciación de micobacterias atípicas.

    El mejor ejemplo de la eficiencia de la técnica fue el caso de la cepa supuestamente identificada como de M.phlei. Mediante la técnica de la PCR pudimos mostrar que la bacteria en cuestión no era M.phlei, ya que en la secuencia del GENEBANK esta micobacteria no posee sitios de corte para las enzimas empleadas en nuestro estudio. Estudios preliminares de secuencia, así como la PCR con otras secuencias blanco (mtp40 e IS6110) confirman nuestros resultados (datos no publicados).

    Una modificación importante del protocolo original y que surge como conclusión de este trabajo, se deriva de la inespecificidad y aparición de falsos positivos utilizando el par de primers SS2-S1A. Por ello se recomienda seleccionar para el futuro sólo la combinación de primers TTS-S1B como específicos. Es importante mencionar que estos primers se asemejan a los que se utilizaron exitosamente en el trabajo de Roth y col.⁽¹²⁾, y por lo tanto ratifica los resultados obtenidos.

    Podemos concluir entonces que la PCR combinada con digestión con enzimas de restricción es un método sencillo, rápido y sensible que permite identificar micobacterias como pertenecientes o no al complejo tuberculosis, mediante la utilización de controles que validen los resultados de la técnica.

    Sin embargo, se deben tomar en cuenta las siguientes recomendaciones:

    • Con la finalidad de verificar los resultados obtenidos en cuanto a la estandarización de los métodos de aislamiento de ADN a partir de cultivos bacterianos, se sugiere probar cantidades equivalentes del cultivo en todos los métodos.

    • Debido a que la técnica de PCR es muy susceptible a la influencia de factores externos, éstos deben ser controlados, para obtener óptimos resultados. Para ello se recomienda tomar una serie de medidas básicas, como lo son la limpieza del sitio de trabajo, el uso de puntas con filtro, seguir un orden específico al agregar los reactivos y el uso de controles.

    • Tomando en cuenta los resultados referidos, y considerando que se presentaron problemas de especificidad con el fragmento amplificado por los primers SS2-S1A, se recomienda el uso de la PCR en combinación con la digestión enzimática (NheI) solamente con el fragmento TTS-S1B. El uso del fragmento TTS-SS2 se recomienda como control de la presencia e integridad del ADN bacteriano.

    • A pesar de que las otras especies de micobacterias del complejo tuberculoso (M. africanum y M. bovis), poseen la misma secuencia que M. tuberculosis en la región espaciadora 16S-23S del operón de ADNr, se recomienda verificar los resultados con ambas especies, así como también con otras especies de micobacterias no ensayadas en este estudio.

    • Llevar a cabo un estudio para evaluar la efectividad de este método de identificación realizado con ADN aislado a partir de muestras clínicas contaminadas con micobacterias.

    • Se recomienda la inclusión de más controles negativos (otras cepas bacterianas) en la realización de la técnica de la PCR, para incrementar la validez de los resultados de sensibilidad.

    • Obtener la secuencia nucleotídica de las regiones espaciadoras 16S-23S de las nocardias utilizadas (N. asteroides, N. brasiliensis y N. caviae), para verificar los resultados obtenidos por la PCR.

    • Verificar los resultados obtenidos por digestión enzimática contra el patrón de RFLP de HaeIII en el trabajo de Roth y col.⁽¹²⁾.

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