Aislamiento selectivo de Nocardia brasiliensis de muestras de suelo de San Juan de Lagunillas, estado Mérida, Venezuela, usando medio con tetraciclina.

Selective isolation of Nocardia brasiliensis from soil samples from San Juan de Lagunillas, Mérida State, Venezuela, using a tetracycline medium.

Uzcátegui-Negrón M, Serrano JA, Díaz-Corrales F, Avella J.

Grupo de Investigación de Actinomicetos Patógenos Humanos y del Suelo, Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

RESUMEN

    Se estudiaron 20 muestras de suelo recogidas en San Juan de Lagunillas, estado Mérida (Venezuela). Se utilizó el medio agar tripticasa soya suplementado con tetraciclina (5µg/ml) y cicloheximida (100µg/ml) para el aislamiento de los microorganismos presentes en las muestras de suelo. Se aislaron 13 (65%) cepas las cuales se identificaron como nocardias. Luego estas cepas se sometieron a pruebas de identificación microbiológica por medio de estudios fisiológicos y citoquímicos. Del total de las cepas de Nocardia aisladas se observó la siguiente proporción: el 10% de las cepas se identificó como Nocardia asteroides Nocardia asteroides, otro 10% como Nocardia sp, y el 45% restante se identificó como Nocardia brasiliensis Nocardia brasiliensis.

    En el medio de aislamiento selectivo se utilizó tetraciclina incorporado al mismo, lo que permitió un mayor aislamiento de cepas de Nocardia brasiliensis y en un menor grado de Nocardia asteroides.

ABSTRACT

    20 soil samples collected from San Juan de Lagunillas, Estado Mérida (Venezuela) were studied. An agar tripticasa soy medium was used supplemented with tetracycline (5µg/ml) and cicloheximida (10µg/ml) for the isolation of the microorganisms that were present in the soil samples. 13 (65%) of the isolated strains were identified as nocardias. Later, these strains were identified through microbiological tests. From the total number of isolated Nocardia strains, the following proportion was observed: 10% of the isolated were identified as Nocardia asteroides, another 10% as Nocardia sp, and the remaining 45% were identified as Nocardia brasiliensis.

    Tetracycline was used in the selective medium of isolation. This process allowed a greater isolation of Nocardia brasiliensis and to a lesser degree Nocardia asteroides.

Palabras-clave: Nocardia brasiliensis, muestras de suelo, Nocardia asteroides.

INTRODUCCIÓN

    Nocardia brasiliensis es uno de los agentes causales del micetoma, siendo el suelo su principal reservorio [1,2]. El micetoma es una infección subcutánea crónica, en la cual se presentan tumores fistulosos en los que se encuentra la nocardia en forma de agregaciones de micelios conocidos como gránulos actinomicóticos (microcolonias). Las lesiones del micetoma son más frecuentemente observadas en las extremidades inferiores, generalmente debidas las mismas a traumatismos con espinas o astillas de madera contaminadas [3]. Nocardia brasiliensis pertenece al género Nocardia, grupo que está constituido por bacterias Gram-positivas, parcialmente o no alcohol-ácido-resistentes, aerobias estrictas y de crecimiento filamentoso ramificado, que fragmentan en cocos o bacilos [4,5].

    A nivel ecológico, estos microorganismos se han aislado en suelos de todo el mundo, considerándose como bacterias saprófitas, capaces de degradar la materia orgánica [6]. Nocardia brasiliensis ha sido principalmente reportada en suelos de regiones tropicales y subtropicales [1,7].

    En lo que respecta a sus características morfológicas macroscópicas de cultivo en medios sólidos, Nocardia puede variar mucho, en cuanto a la especie o cepa, el tiempo de incubación y el medio de cultivo utilizado [4,5]. Al microscopio, se observan en forma de hifas finas ramificadas, que fragmentan en cocos y bacilos Gram-positivos. La pared celular de los microorganismos pertenecientes al género Nocardia es del tipo IV, la cual está compuesta por ácido N- glicolimurámico y N-acetilglucosamina, ácido mesodiaminopimélico (mesoDAP), ácido D-glutámico, D-alanina y L-alanina; además contiene una fracción de arabinosa-galactosa, menaquinonas tetrahidrogenadas y los ácidos micólicos [8].

MATERIALES Y MÉTODOS

    Se procesaron 20 muestras de suelo provenientes de San Juan de Lagunillas, estado Mérida, las cuales se recolectaron manualmente en distintos sitios del perímetro urbano de esa localidad. A continuación, las muestras se cernieron y pesaron, y posteriormente se tomó 1g de tierra y se suspendió en 0,5ml de solución salina fisiológica y, a partir de esta solución, se realizaron diluciones dobles seriadas. En seguida se sembró las muestras en medio de agar tripticasa de soya suplementado con tetraciclina (5 µg/ml)y cicloheximida (100µg/ml). En cada una de las placas se trasvasaron 0,1ml de cada dilución de las muestras, previamente.

    Las muestras sembradas se incubaron a 37°C por dos semanas. Del crecimiento obtenido se tomaron las colonias que eran sugestivas de ser nocardias. Éstas se repicaron a placas de Petri con medio de infusión cerebro-corazón (BHI) y también con medio de Middlebrook 7H9. Las cepas aisladas se codificaron de manera alfabética, desde la letra "A" hasta la letra "J". La morfología microscópica se corroboró utilizando la técnica de cultivo en laminilla de Kowate y Shenobo, y se estudiaron al microscopio luego de ser teñidas por el método de Gram [5].

    Para la identificación de las cepas aisladas se utilizaron distintos sustratos, tales como xantina, hipoxantina, caseína, tirosina, urea y lizosima, mismos que son degradados de forma característica por cada una de las especies pertenecientes al género Nocardia [9,5].

    Para determinar la composición química de la pared celular de las cepas aisladas, se utilizó el análisis citoquímico, para así determinar la presencia de dos componentes característicos del género Nocardia, como son los ácidos micólicos y el ácido mesodiaminopimélico [9, 10]. Estos estudios se realizaron utilizando biomasa celular de cada una de las cepas aisladas, que se cultivaron en caldo nutriente a 37°C por dos semanas, a 150 rpm de agitación orbital. A continuación, los cultivos se trataron con formol al 1,5% durante toda una noche y se recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces con agua destilada y se secaron en estufa a 37°C. La biomasa obtenida se utilizó para preparar los extractos celulares y para realizar la cromatografía de lípidos y aminoácidos. Los lípidos (ácidos. micólicos) se extrajeron por metanólisis ácida a 55°C [8]; y la extracción de los aminoácidos (Meso-DAP) se realizó por medio de la hidrólisis ácida a 100°C [5].

    Se realizaron controles con cepas conocidas de Nocardia brasiliensis (GP-2), Nocardia asteroides (GUH-2), Nocardia asteroides (ATCC14759), R. rhodochorous, Nocardia otitidiscaviarum (GAM-5) y S. somaliensis, pertenecientes a la colección "Enrique Tejera" del Grupo de Investigaciones de Actinomicetos Patógenos de Mérida (GIIAP-Mérida).

    La identificación de cada cepa de Nocardia se consideró definitiva cuando todas las pruebas microbiológicas convencionales respondían a la presencia de las características propias de cada especie del género Nocardia.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

    De acuerdo con el análisis microbiológico aplicado a las muestras de suelo, se obtuvo un total de 13 cepas, de las cuales un 23% correspondió a Nocardia asteroides, otro 23% a Nocardia sp, y el 54% restante se identificó como Nocardia brasiliensis (Ver figura 1).

Figura 1. Especies de nocardia aisladas, indicadas por su porcentaje.

    El cuadro 1 muestra las características morfológicas desde el punto de vista macroscópico y microscópico. También se señala la técnica de coloración de Gram y la técnica del microcultivo. Las características predominantes fueron a nivel macroscópico, donde las colonias coincidieron en presentar un aspecto seco, como de tiza, de color blanco, con olor a tierra, y la mayoría produjeron un exopigmento de color marrón. Asimismo, en cuanto a la morfología microscópica, predominó la presencia de una extensa ramificación con una fragmentación en cocos y bacilos Gram-positivos. Este patrón porcentual similar se encontró para las cepas de Nocardia asteroides y cepas de Nocardia brasiliensis.

Cuadro 1. Morfología macro y microscópica, coloración de Gram y microcultivo.

    El cuadro 2 indica la degradación de los sustratos utilizados para realizar la identificación a nivel de especie, observándose que Nocardia asteroides no degrada ninguno de los sustratos, excepto la urea y la lizosima; por el contrario Nocardia brasiliensis degrada todos excepto la xantina.

Cuadro 2. Análisis bioquímico de las cepas de Nocardia aisladas en San Juan de Lagunillas, estado Mérida, Venezuela.

    El cuadro 3 presenta la constitución química de la pared celular de las 13 cepas aisladas de Nocardia asteroides y Nocardia brasiliensis. Nocardia brasiliensis. En esta tabla se muestra la presencia positiva del ácido diaminopimélico (Meso-DAP) y los ácidos micólicos, los cuales son constituyentes propios de la pared tipo IV de las nocardias. Para efectos de estudio control se estudiaron cepas de referencia conocidas y se utilizó como control del Meso-DAP, comercial de la casa Sigma.

Cuadro 3. Análisis citoquímico de las cepas de Nocardia aisladas en San Juan de Lagunillas, estado Mérida, Venezuela.

    Los resultados obtenidos en este estudio indican una alta prevalencia de Nocardia brasiliensis (54%) con respecto a Nocardia asteroides en suelos de San Juan de Lagunillas. De igual manera, van Gelderen y cols. (6) encontraron que Nocardia brasiliensis fue la población predominante, utilizando como método de aislamiento el paraffin bait, en muestras de suelos de Tucumán. Esto indica que tanto el método con tetraciclina y cicloheximida, como la técnica del paraffin bait, pueden ser consideradas como métodos valederos para el aislamiento de Nocardia brasiliensis. Uzcátegui-Negrón y col. [11], utilizando la técnica del paraffin bait, lograron aislar de muestras recogidas en cinco estados de Venezuela, más cepas de Nocardia asteroides que de Nocardia brasiliensis. Es necesario que se puedan establecer métodos que permitan el estudio de la distribución de estos microorganismos en suelos de las diferentes regiones del país, en particular en aquellos suelos de regiones del país donde las infecciones por los actinomicetos patógenos productores de micetoma tienen mayor prevalencia.

    La aplicación de métodos de aislamiento selectivo con medios que contengan antibióticos como la tetraciclina, novobiocina, rifampicina, etc., indican algunas de las posibilidades de aislar actinomicetos pertenecientes a una taxa en particular, y sugiere de igual forma la posibilidad de separar cepas pertenecientes a diferentes especies del mismo género [12-14].

AGRADECIMIENTOS

    Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico Humanístico y Tecnológico de la Universidad de Los Andes (CDCHT-ULA). Subvención N° M-738-01-07-A.

REFERENCIAS:

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3. González-Ochoa A. Mycetoma by Nocardia brasiliensis. Inst. Salubr. Enferm. Trop. 1962, 22:15-24.        [ Links ]

4. Serrano JA, Beaman B, Viloria J, Mejía M, Zamora T. Microbiological and ultraestructural studies of human actinomycetomas. Sixth International Symposium on Actinomycetes Biology, 1985. 78:647-667.        [ Links ]

5. Serrano JA, Sandoval A. Manual de laboratorio para el estudio de los actinomicetales patógenos. Consejo de Publicaciones-Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela, 1985.        [ Links ]

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11. Uzcátegui-Negrón M, Serrano JA, Rojas K, García E, Díaz-Corrales F, Cuble A, Casoli E, Renaud F, Boiron P. Aislamiento de Nocardia asteroides de muestras de suelo de cinco estados de Venezuela. Rev Soc.Ven.Microbiol. 2001, 21:17-23.        [ Links ]

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