Implementación de un protocolo para la identificación de Vibrio parahaemolyticus

a través de PCR.

Implementation of a protocol for the identification of Vibrio parahaemolyticus by PCR.

Arévalo Z1, Clavijo AM², Rolo de M², Álvarez M³, Conroy D⁴, Infante D², Santander J².

1. Magister Scientiarum en Microbiología, Hospital Central de Maracay, Maracay, estado Aragua, Venezuela. Email: zorenarevalo@hotmail.com.

2. Sanidad Animal-CENIAP-INIA. Maracay, Edo. Aragua.

3. Laboratorio Genomik, Maracay, Edo. Aragua.

4. FARMAFISH. Maracay, Edo Aragua.

RESUMEN

Vibrio parahaemolyticus es una de las principales bacterias Gram-negativas causantes de toxiinfecciones alimentarias y gastroenteritis aguda en humanos. En peces causa septicemia hemorrágica y ulceraciones de la piel, convirtiéndose en una de las principales causas de pérdidas en las explotaciones piscícolas. El presente trabajo documenta el establecimiento de un protocolo de identificación de Vibrio parahaemolyticus por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se realizaron caracterizaciones genómicas de 24 aislados de Vibrio sp., obtenidos del cepario del laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA en Maracay, estado Aragua, Venezuela. En la identificación genética los aislados fueron caracterizados mediante la PCR, siguiendo la metodología descrita por Lee y col. (1) con modificaciones en la extracción del ADN, que se realizó con DNAzol^®. Los iniciadores utilizados para tal fin fueron: 5'-GCGAATTCGATAGGGTGT TAACC-3’ y 5'-CGAATCCTTGA ACATACGCAGC-3'. De los 24 aislados analizados por PCR se obtuvieron 7 amplificados, que se identificaron como V. parahaemolyticus.

Palabras-clave: Protocolo, PCR, Vibrio parahaemolyticus.

ABSTRACT.

Vibrio parahaemolyticus is one of the main Gram-negative bacteria causing food poisoning and acute gastroenteritis in humans, it causes hemorrhagic septicemia and ulcer on fish skin, becoming one of the major loss causing in fish explotation. This work shows the establishment of a protocol of identification of V. parahaemolyticus by polymerase chain reaction. There were made genetic characterizations of 24 Vibrio sp. isolates gotten from Bacteriology laboratory Sanidad Animal-CENIAP-INIA in Maracay, Aragua state. In genomic identification the isolates were characterized through PCR, following the methodology from Lee and col. (1995) with modifications in the extraction of DNA which was made with DNAzol^®. The primers used were 5'-TGCGAATTCGATAGGGTGT TAACC-3' and 5'-GAATCCTTGAA CATACGCAGC-3'. From 24 isolates analyzed by PCR, it was gotten 7 amplified which were identified as V. parahaemolyticus.

INTRODUCCIÓN

Dentro de las enfermedades bacterianas más comunes en la acuicultura marina y estuarina, en peces, moluscos y crustáceos, figura la vibriosis. Las especies de Vibrio, patógenas y no patógenas, constituyen la flora microbiana más común en ambientes marinos y estuarinos, demostrándose que una variedad de especies de Vibrio están asociados con vibriosis (2-4).

Park y col. señalan que nueve especies de Vibrio son patógenos a las especies marinas, cinco de los cuales son conocidos patógenos humanos. Las especies de más alto riesgo para los humanos incluyen V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus y V. damsela (L. damsela). Otras especies relacionadas con patologías humanas son: V. mimicus, V. furnissii y V. fluvialis. Las especies restantes, V. carchariae, V. salmonicida, V. ordalii y V. anguillarum (L. anguillara) asociadas a infecciones en peces no se cree que sean de riesgo al humano (5).

Las especies de Vibrio son ampliamente conocidas por el papel que juegan en las infecciones intestinales humanas; la diarrea producida por V. parahaemolyticus y V. cholerae son importantes mundialmente, así como también los brotes de enfermedades trasmitidas por alimentos causadas por V. parahaemolyticus en el Japón (6-8).

Vibrio parahaemolyticus produce la hemolisina directa termoestable (TDH), que ha sido implicada en la diarrea acuosa causada por este organismo y con el fenómeno Kanagawa (9). La toxina purificada, cuando es inyectada por vía intraperitoneal o venosa, es letal en pequeños animales de experimentación (10, 11).

El fenómeno Kanagawa es la hemólisis tipo b producida sobre agar Wagatsuma, y es causada por altos niveles de producción de la hemolisina termoestable directa, que es codificada por el gen tdh, la cual es detectada casi exclusivamente en los aislados clínicos de recién estudio; raras veces es producida por aislados ambientales. La distribución de este gen y el gen trh se ha estudiado en los aislados de vibrios por análisis de hibridización (12-15).

El diagnóstico de las toxiinfecciones requiere de la pronta identificación del microorganismo causante de la misma, lo que requiere de varios días con el empleo de técnicas manuales y que, en el caso de vibrios ambientales, presenta ciertas dificultades, debido a su gran diversidad, lo cual produce un constante cambio en la taxonomía de las Vibrionaceae y se refleja en el número de nuevas referencias y estudios taxonómicos propuestos.

El descubrimiento de la tecnología molecular hace factible la detección del patógeno microbiano de forma rápida, sensible y económica (16). De esta manera la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desde su introducción en 1985, ha transformado las vías de análisis del ADN llevadas a cabo en laboratorios clínicos y de investigación (17, 18). Ha sido usada con éxito en la rápida detección de varios patógenos microbianos de aguas ambientales, muestras clínicas y productos alimenticios con alta especificidad y sensibilidad (19).

En la PCR se produce desnaturalización del ADN genómico, hibridación y extensión o elongación de la cadena. La introducción de una ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa), mejoró sustancialmente la especificidad y rendimiento de la reacción de amplificación y el tamaño de los productos amplificados (20, 21).

Esta técnica es un instrumento preciso para la identificación de aquellos aislados implicados en procesos infecciosos, así como en estudios epidemiológicos. De allí la importancia de establecer un protocolo en la caracterización genética de aislados de V. parahaemolyticus por la técnica de PCR.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizaron caracterizaciones genéticas de 24 aislados de Vibrio sp. obtenidos del cepario del laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA, en Maracay, estado Aragua. Los aislados fueron caracterizados mediante la PCR, siguiendo la metodología descrita por Lee y col. (1, 22), con modificaciones en la extracción del ADN, que se realizó con DNAzol^®. El DNAzol^® es un reactivo que se emplea en el aislamiento del ADN genómico de diferentes fuentes. La combinación del pH y el tiocianato de guanitidina lisa la pared celular e hidroliza el ARN en un solo paso, después de la cual el ADN genómico se precipita y purifica con etanol. (23-25). Los iniciadores utilizados para tal fin fueron: 5'-TGCGAATTCGATAGGGT GTTAACC-3’ y 5'-CGAATCCTTGAA CATACGCAGC-3'. La mezcla de reacción contenía 5 µ1 de buffer A, 1,25 U de la Taq polimerasa, 200 µM de cada desoxinucleótido trifosfato,1 µM de cada iniciador, 1 µl del ADN muestra y agua libre de nucleasa, para hacer un volumen final de 50 µl, siendo sometida a 35 ciclos; la desnaturalización a 94°C por 1 min., alineación de los iniciadores 56°C por 1 min., con una primera extensión de 72°C por 1 min. y una extensión final a 72°C por 10 min. Los amplificados fueron visualizados con LUV en gel de agarosa al 1,5%. Se utilizó una cepa control de V. parahaemolyticus proveniente del Instituto Nacional de Higiene, controles negativos y un marcador de peso molecular Ladder 100 pares de bases. El producto amplificado fue de 387 pares de bases.

RESULTADO Y DISCUSIÓN

La prueba de PCR generó un producto amplificado de 387 pares de bases (pb) ubicado entre las bandas 300 y 400 pb del marcador de peso molecular Ladder l00pb. similar al control positivo de V. parahaemolyticus, por lo que se considera que hubo amplificación para los ADN evaluados. Donde no hubo amplificación no se observó la formación de las bandas, como sucedió con los controles negativos, tal como fue establecido por Lee y col. (ver figura 1).

Figura 1. Amplificados de ADN de V. parahaemolyticus por PCR.

CONCLUSIONES

1. Se estableció un protocolo para la caracterización genética de Vibrio parahaemolyticus, demostrando su aplicabilidad a través del presente estudio.

2. La identificación de Vibrio parahaemolyticus constituye un hallazgo importante, ya que es un riesgo en salud pública, debido a que el principal mecanismo de transmisión es el consumo de agua y alimentos contaminados con los mismos.

3. La PCR es una importante técnica de biología molecular, muy precisa y de gran ayuda en la identificación rápida de microorganismos, que requiere cuidado en su empleo.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Fundacite Aragua el financiamiento parcial del presente trabajo.

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