Aislamiento de Vibrio cholerae a partir de lisas y tilapias en Venezuela.

Isolates of Vibrio cholerae from lisas and tilapias in Venezuela.

Arévalo Z¹, Clavijo AM², Rolo de M², Álvarez M³, Conroy D⁴, Infante D², Santander J².

1. Magister Scientiarum en Microbiología, Hospital Central de Maracay, Maracay, estado Aragua, Venezuela. Email: zorenarevalo@hotmail.com.

2. Sanidad Animal-CENIAP-INIA. Maracay, Edo. Aragua.

3. Laboratorio Genomik, Maracay, Edo. Aragua.

4. FARMAFISH. Maracay, Edo Aragua.

Palabras-clave: Lisas, tilapias, Vibrio cholerae.

RESUMEN

Un importante patógeno humano es Vibrio cholerae, causante de diarreas profusas (cólera) y otros desórdenes. Su transmisión está asociada con el consumo de alimentos marinos contaminados. En el presente estudio se realizaron caracterizaciones fenotípicas de 24 aislados de Vibrio sp. obtenidos por necropsia y del cepario del Laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA en Maracay, estado Aragua; entre los cuales fue aislado Vibrio cholerae proveniente de lisas y tilapias. Las técnicas de identificación bacteriana se basan en sus características fenotípicas y metabólicas, desarrollo de colonias en medios de cultivos, morfología microscópica y reacciones tintoriales y características bioquímicas basadas en la utilización de sustratos. En los ejemplares de tilapia estudiados se identificó Vibrio cholerae no-O1 y en las lisas, predominaron Vibrio parahaemolyticus y Vibrio cholerae no-O1. Este hallazgo es de gran importancia sanitaria, ya que los peces son de consumo humano, lo que constituye un riesgo en salud pública.

ABSTRACT

An important human pathogen is Vibrio cholerae, producing severe diarrhea (cholera) and other disorders. Is transmitted on contaminated food, especially seafood. In this investigation it was made phenotypic characterizations of 24 isolates of Vibrio sp. gotten by necropsy from isolates of Laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA in Maracay city, Aragua state, Venezuela; among which it was isolated Vibrio cholerae on lisas and tilapias. Bacterial identification technics are based upon phenotypical and metabolic characteristics; growth of colonies in culture media, microscopic morphology and dye reactivity, and biochemical characteristics based on use of substratum. On tilapia specimens studied it was identified not-O1 Vibrio cholerae and on lisas Vibrio parahaemolyticus and not-O1 Vibrio cholerae. An sanitary important discovery, as fish species studied are human-consumption food, which constitutes a public health issue.

INTRODUCCIÓN

La incidencia de enfermedades por consumo de mariscos contaminados, especialmente ostras crudas, es un problema primario de la industria alimenticia y de salud pública (1).

La mayoría de las epidemias de enfermedades alimenticias son producidas por Vibrio sp., el cual es autóctono o proviene del medio marino, y han ocurrido por almacenamiento inadecuado o contaminación de fuentes de alimentos crudos (2). Durante los meses de verano, la prevalencia de vibrios patógenos (3) y halofílicos en alimentos marinos constituye un peligro para la salud pública en países subtropicales (4-6).

Vibrio cholerae es una importante causa de cólera en los humanos, causando formas severas como diarrea profusa, vómitos y dolores musculares. La transmisión de este organismo está asociado con el consumo de alimentos contaminados, principalmente de origen marino, y con frecuencia de aguas contaminadas (7).

El incremento poblacional ha traído como consecuencia la búsqueda de alimentos sanos en cantidad abundante y a bajo costo. El pescado cumple con todos estos requerimientos; de ahí la importancia que tiene hacer investigaciones que garanticen su salubridad (8-9).

Los métodos bacteriológicos tradicionales para la identificación de especies de vibrios son confiables y seguros, lo que conlleva al diagnóstico y, la terapia a seguir.

MATERIALES Y MÉTODOS

Métodos fenotípicos.

Se aplicaron métodos fenotípicos para analizar 24 cepas provenientes de lisas y tilapias. Las cepas numeradas como 14 y 16 se obtuvieron por necropsia, para lo cual se utilizaron ejemplares de tilapias de fincas comerciales del estado Carabobo. Dichos ejemplares se trasladaron al Laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA en bolsas plásticas con aireación suplementada con oxígeno, herméticamente cerradas y colocadas en una caja isotérmica de anime. Se practicó un examen minucioso de las partes externas e internas de cada animal, siguiendo la técnica recomendada por Conroy y Conroy (10).

En el examen externo se detalló la superficie corporal, aletas, opérculos, branquias y ojos, con el fin de detectar alteraciones tales como variación en la coloración, exceso de mucus, señales de congestión, lesiones, hemorragias, tumores, abscesos y otras anormalidades.

En el examen interno se desinfectó la superficie dorso-lateral con alcohol y se procedió a la necropsia, donde se observó la cavidad abdominal y los órganos internos, tales como: bazo, hígado, corazón y riñón, buscando la presencia de necrosis, zonas congestionadas, variación en la coloración, tamaño y textura, así como la presencia de hemorragias y acumulación de líquidos, entre otros.

Los aislados numerados del 1-13, 15 y 17-24 se tomaron del cepario del Laboratorio de Bacteriología de Sanidad Animal-CENIAP-INIA, los cuales se conservan en gelosa peptonada.

Crecimiento en medios de cultivo

Se procedió a tomar muestras de riñón, las cuales fueron sembradas en diferentes medios de cultivo: agar sangre, agar MacConkey y agar TCBS (11-12).

Los aislados del cepario, conservados en gelosa peptonada, fueron refrescados en caldo cerebro-corazón y de allí sembrados en los medios anteriormente mencionados.

La técnica de siembra se realizó por agotamiento del material sembrado por estrías sucesivas con un asa de platino flameada fría. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente (aproximadamente 28°C) durante 24-48 horas.

Características fisicoquímicas de los aislados estudiados.

Estando las colonias convenientemente separadas, se procedió a determinar las características morfológicas, así como las de cultivo y bioquímicas.

Para identificar las cepas bacterianas a nivel de género se siguió el esquema de Diagnóstico Microbiológico (13) y Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (14).

En la determinación de las características fisicoquímicas se procedió a la realización de la coloración de Gram, para la observación de la morfología, tinción y formación o no de esporas (15). También se realizó la observación de flagelos por microscopía electrónica; para tal fin se utilizó un microscopio electrónico de trasmisión y se aplicó la técnica de sombreado (16).

Se realizó la determinación de las características bioquímicas, con el objeto de conocer el metabolismo bacteriano. Las pruebas aplicadas fueron: prueba de la oxidasa, producción de acidez, H₂S y gas en medio de Kligler, descarboxilación de la arginina, lisina y ornitina, hidrólisis de la gelatina, producción de acetoína, prueba del rojo de metilo, producción de indol, movilidad y reducción de nitratos a nitritos (17-18).

Además de estas pruebas, se realizaron otras complementarias como la prueba de sensibilidad al vibriostato O/129, la prueba de la hebra y la identificación serológica de V. cholerae, a fin de determinar con mayor precisión la especie de la bacteria correspondiente, de conformidad con el esquema de identificación (19).

Se aplicaron pruebas bioquímicas adicionales, tales como la prueba de utilización del citrato y la prueba de ONPG (o-nitofenil-b-D-galactopinanósido), para diferenciar de otros aislados sospechosos (20)(21).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Crecimiento en medios de cultivo. Las colonias en agar MacConkey y TCBS se observaron grandes, de forma lisas, convexas, de consistencia cremosa y de bordes netos (figura 1). En MacConkey se observaron traslúcidas, lactosa-negativas. En TCBS, las colonias que toman la sacarosa del medio se ven amarillas, compatibles con V. cholerae, V. alginolyticus y L. anguillara. Las colonias que no toman la sacarosa son verdes, compatibles con V. parahaemolyticus. Estas características en los medios de cultivo facilitan su identificación y coinciden con las descritas por Balows, Holt y Koneman.

Figura 1. Movilidad por flagelos polares de Vibrio sp. Microscopía electrónica de transmisión. Técnica de sombreado (15.000x).

Muchos de los aislamientos obtenidos fueron de los géneros Aeromonas, Plesiomonas, enterobacterias y bacilos Gram-negativos no fermentadores; pero para este estudio sólo fueron considerados los géneros Vibrio.

Las características fisicoquímicas de los aislados estudiados fueron: bacilos pequeños, delgados, de forma recta o curva, Gram-negativos y no formadores de esporas. Son móviles por flagelos polares (figura 1), oxidasa-positivos, sensibles a una concentración de 150 mg del vibriostato O/129 (figura 2) y formaron hilo mucoide.

Figura 2. Prueba de sensibilidad al vibriostato O/129, donde se observan halos de inhibición característicos de especies de Vibrio sp.

Los resultados de las características fisicoquímicas de los aislados investigados concuerdan con los estudios reportados por Holt, CDC, NCID y OPS, Murray y Koneman.

La identificación definitiva de V. cholerae y V. alginolyticus se logró con la aplicación de la prueba de utilización de citrato y la prueba de ONPG, como establece el Manual Bergey’s, siendo positivas en V. cholerae y negativas en V. alginolyticus.

En la aglutinación serológica de V. cholerae ningún aislado aglutinó con el antisuero polivalente, por lo cual se consideran V. cholerae no-O1.

En el cuadro 1 se observa que bioquímicamente se identificaron 24 aislados de Vibrio sp. y L. anguillara, predominando V. parahaemolyticus (7=29,2%). V. cholerae no-O1 y V. alginolyticus se encuentran en igual proporción (6=25%), mientras que Listonella anguillara se aisló con menor frecuencia (5=20,8%).

Cuadro1. Distribución de aislados de Vibrio spp. y Listonella spp. por especie.

La distribución bacteriana para las especies de peces analizados se presenta en el cuadro 2, observándose un predominio de V. parahaemolyticus (38,9%) en lisas, seguido de V. cholerae no-O1 (33,3%) y L. anguillara (27,8%). En tilapias V. cholerae no-O1 y V. alginolyticus presentaron una frecuencia de 50% cada uno.

Se identificó V. cholerae no-O1 con una frecuencia notoria, además de otros aislados de vibrios, los cuales son patógenos potenciales del hombre. Este hecho constituye un riesgo importante en salud pública, debido a que, como es bien sabido, el principal mecanismo de transmisión es el consumo de agua y alimentos contaminados con los mismos. Esto también es un reflejo de la calidad bacteriológica del ambiente, que se relaciona con las especies acuícolas que conviven en aguas marinas, dulces y salobres contaminadas, cercanas a la población, quienes los consumen y los comercializan a otras poblaciones, asociándose con brotes de infecciones y toxiinfecciones alimentarias, y es por ello que constituyen vectores significativos de enfermedades entéricas, tal como lo han dicho Clavijo y Santander (9) y Gráu (22).

Cuadro 2. Aislados de Vibrio spp. y Listonella spp. identificados en lisas, tilapias y cachamas.

Álvarez y Agurto (23)(24) lo identificaron en tilapias silvestres; mientras que esta investigación determinó su presencia en tilapias de cultivo y en lisas de captura. La presencia de V. cholerae no-O1 coincide con lo expresado por Gráu, quien reportó esta bacteria, entre otras, en pepitonas del Morro de Chacopata, estado Sucre.

Estos hallazgos también coinciden con lo expresado por la CDC, NCID y la OPS, en cuanto a que las enfermedades diarreicas han sido una de las causas de mayor morbilidad y mortalidad en las Américas y en las regiones con menor desarrollo. El patrón epidemiológico endémico se ha caracterizado por las altas tasas de incidencia y de letalidad, sobre todo en niños.

CONCLUSIONES

1. Las especies más frecuentemente aisladas fueron: Vibrio parahaemolyticus (29,2%), seguida de Vibrio cholerae no-O1 (25%), Vibrio alginolyticus (25%) y Listonella anguillara (20,8%).

2. En los ejemplares de lisa (captura), predominó Vibrio parahaemolyticus (38,9%) y Vibrio cholerae no-O1 (33,3%). Además, se aisló Listonella anguillara (27,8%).

3. En los ejemplares de tilapia (cultivo), se identificó Vibrio cholerae no-O1 y Vibrio alginolyticus en igual proporción (50%).

4. Se observó que la presencia de Vibrio cholerae no-O1 y de otros vibrios guardó relación con la mayor población humana y condiciones sanitarias deficientes, que hacen factible la infección. Estos hallazgos son importantes, por el hecho de ser patógenos en humanos y ser un reflejo de la precaria situación sanitaria de la región, desprovista de sistemas de recolección y deposición de las aguas residuales.

5. La identificación, a través de técnicas bioquímicas de los aislados de Vibrio sp. y L. anguillara sigue siendo la primera herramienta para la clasificación de los mismos, debido a su disponibilidad y validez, aún cuando se requieran varios días para obtener resultados.

RECOMENDACIONES

1. Continuar la investigación de la bacterioflora en lisas, tilapias y cachamas silvestres y de cultivo en diferentes zonas del país, con el fin de identificar potenciales patógenos de los peces y del hombre, ya que algunos de ellos implican problemas de salud pública.

2. Continuar con el empleo de los métodos bioquímicos tradicionales, los que han demostrado que no han perdido vigencia, aún cuando existan técnicas más modernas.

3. Mantener una vigilancia epidemiológica estrecha, con el fin de crear estrategias para la protección de la salud humana y para un mejor desarrollo de la acuicultura.

4. Realizar campañas de educación sanitaria a la población sobre el peligro que constituye el consumo de pescados crudos o con poca cocción, así como de la adecuada disposición de excretas que eviten la contaminación de las aguas y la aplicación de medidas que obliguen el tratamiento de aguas servidas, para evitar que éstas contaminen los reservorios naturales y a las especies ícticas.

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen a Fundacite-Aragua el financiamiento parcial del presente trabajo.

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