Mantenimiento de Cryptococcus sp. con el método de Castellani.

Preservation of Cryptococcus sp. with the Castellani method.

Pérez C*, Mata-Essayag S*, Hartung de Capriles C*, Roselló A*, Colella MT*, Olaizola C*, Landaeta ME**.

* Sección de Micología Médica, Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela.

** Servicio de Infectología, Hospital Universitario de Caracas, Universidad Central de Venezuela.

RESUMEN

Las dificultades para mantener cepas de bacterias y de hongos viables durante diferentes períodos de tiempo, sin cambios morfológicos ni fisiológicos, son bien conocidas. Existen métodos de conservación con diferentes niveles de eficacia, tales como el subcultivo periódico, la liofilización, la inmersión en aceite mineral y el método de Castellani [1-3].

En 1989, Hartung y colaboradores lograron demostrar la eficiencia de este método para la conservación de hongos, mantenidos en la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Central de Venezuela desde 1962 [4,5]. En la literatura existen pocos trabajos que reportan la efectividad de dicho método [5-8].

El presente estudio evalúa la estabilidad morfológica, viabilidad y pureza de 26 cepas de Cryptococcus sp. provenientes de la micoteca de esta sección, las cuales fueron aisladas de diversas muestras clínicas y conservadas utilizando el método de Castellani, desde 1962 hasta 2002.

ABSTRACT

The difficulties to keep bacterial or fungal strains viable, morphological and physiological stable during variable periods of time, are well known. Different conservation methods with diverse levels of efficiency are therefore in use: periodical sub culturing, liophilization, mineral oil immersion and the Castellani method among others.

In 1989 Hartung et al. confirmed the effectiveness of this method to preserve fungi, kept in collection at the medical mycology section at the Tropical Medicine Institute in the Universidad Central de Venezuela since 1962.

The present study evaluates the morphological stability, viability and purity of 26 Cryptococcus sp. strains kept in this collection for variable periods of time, up to 40 years.

INTRODUCCIÓN

En un laboratorio de Micología o Bacteriología es indispensable mantener cepas puras de los microorganismos aislados, debido a que éstos suelen ser considerados como material necesario para la enseñanza, investigación y como testigos para estudios especiales. En este sentido, resulta de gran importancia conservar los cultivos de las bacterias y hongos puros y debidamente identificados. Naturalmente, cada laboratorio trata de mantener la colección de cultivos en forma adecuada a sus necesidades e intereses.

Las dificultades para mantener cepas de bacterias y de hongos viables durante diferentes períodos de tiempo, sin cambios morfológicos ni fisiológicos, son bien conocidas. Existen métodos de conservación con diferentes niveles de eficacia, tales como el subcultivo periódico, la liofilización, la inmersión en aceite mineral y el método de Castellani [1-3].

Estos métodos de conservación, en su mayoría, resultan muy costosos, de una tecnología muy elaborada y, por lo tanto, de difícil aplicación en un laboratorio pequeño y de escasos recursos.

Desde 1962, en la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Central de Venezuela se viene utilizando el método modificado de Castellani para la conservación de hongos y de algunos actinomicetos aerobios [4]. En 1989, Hartung y colaboradores lograron demostrar la eficiencia de este método para la conservación de hongos [5]. En la literatura existen pocos trabajos que reportan la efectividad de dicho método [5-8].

El presente estudio evalúa la estabilidad morfológica, viabilidad y pureza de 26 cepas de Cryptococcus sp. provenientes de la micoteca de esta sección, las cuales fueron aisladas de diversas muestras clínicas y conservadas utilizando el método de Castellani, desde 1962 hasta 2002.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas estudiadas:

Se utilizaron 26 cepas de Cryptococcus sp. provenientes de la micoteca de la Sección de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad Central de Venezuela, las cuales fueron aisladas de diversas muestras clínicas y conservadas utilizando el método de Castellani. Éstas fueron introducidas en el agua destilada entre los años 1962 y 2000. Una cepa estuvo mantenida por 40 años; 4 por 33 años, 12 por 16 años, 3 por 9 años, 3 por 6 años, 2 por 2 años y una por 1 año.

Procesamiento de las cepas estudiadas

Para poder evaluar las cepas de la micoteca conservadas en los tubos con agua destilada se procedió a realizar la antisepsia con alcohol de la tapa de baquelita; se agitó el tubo para no dejar sedimento y se vertió el contenido del mismo en un tubo con medio de Sablac; se colocaron en estufa a 35°C hasta observar el crecimiento de las colonias.

Pruebas bioquímicas y de termotolerancia, utilizadas para la identificación de las cepas de Cryptococcus sp.

Identificación automatizada: Todas las cepas estudiadas, se identificaron a través del método automatizado MicroScan^® DADE BEHRING [9,10], utilizando los paneles de identificación rápida de levaduras.

A partir de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 35°C en el medio de Sablac, se procedió a preparar un inóculo de cada cepa, mezclando suficiente material del cultivo arrastrado con el asa y diluyéndolo en 2 ml de agua destilada estéril, hasta obtener una densidad de 0,5 Mac Farland. Se distribuyó el inóculo a razón de 50 µl en cada uno de los pozos de los paneles de identificación. Los paneles se sellaron con parafilm y se colocaron en la estufa a 35°C por 4 horas. Posteriormente, se procesaron de manera automatizada en el aparato de MicroScan^® DADE BEHRING, para la identificación de la especie.

Prueba de la ureasa

Agar urea de Christensen: Peptona 1 g, cloruro de sodio 5 g, rojo de fenol 0,012 g, agar 20 g, glucosa 1 g, urea Oxoid^® amp 40% 20 g, agua destilada 1000 ml, pH final 6,8 [10,11].

Se disolvieron en el agua destilada la peptona, el cloruro de sodio, el rojo de fenol, la glucosa y el agar. Se distribuyeron en matraces de 100 ml cada uno y se esterilizaron por autoclave a 20 Lb por 15 min. Posteriormente, y con el medio aún fundido (50°C), se agregó la urea, que ya viene esterilizada por filtración.

Se distribuyó la mezcla en tubos con tapa de baquelita previamente esterilizados por autoclave, a razón de 3 ml en cada uno; se dejó solidificar formando taco y bisel.

Caldo urea de Stuart: Extracto de levadura 0,1 g, fosfato monopotásico 9,1 g, fosfato disódico 9,5 g, rojo de fenol 0,01 g, urea 20 g, agua destilada 1000 ml, pH final 6,8 [11]. Se mezclaron todos los constituyentes en el agua. Se distribuyeron en tubos con tapa de baquelita, a razón de 2 ml por cada tubo. Se esterilizaron en autoclave a 8 Lb por 10 min.

Cepas control

Control positivo: Cryptococcus neoformans (WC 1400 IMT)

Control negativo: Candida albicans (ATCC 90028)

Utilizando un cultivo de 48 horas de crecimiento en Sablac a 35°C, se arrastró suficiente cantidad de colonias y se sembraron en 2 tubos con el caldo urea de Stuart y en 2 tubos con el agar urea de Christensen. Un tubo con cada uno de los medios se incubó en estufa a 35°C y los 2 tubos restantes permanecieron a temperatura ambiente (23-28°C).

Los medios de cultivo se observaron diariamente, hasta un máximo de 5 días. La reacción que se evaluó fue el viraje del color del medio de amarillo a fucsia.

Interpretación de resultados

Color rosado intenso o fucsia: Hidrólisis de la urea.

Color amarillo o rosado muy claro: Ausencia de hidrólisis de la urea.

Prueba de auxanograma

Medio para la asimilación de carbonos (medio de Lodder): Sulfato de amonio (NH₄)₂SO₄ 5,0 g; fosfato de potasio monobásico KH₂PO₄ 1,0 g; sulfato de magnesio heptahidratado MgSO₄.7H₂O 0,5 g; agar 20 g, agua destilada 1.000 ml [11].

Medio para la asimilación de nitratos (medio de Lodder): Dextrosa 20 g; fosfato de potasio monobásico KH₂PO₄ 1,0 g; sulfato de magnesio heptahidratado MgSO₄.7H₂O 0,5 g; agar 20 g; agua destilada 1.000 ml [11].

Para la preparación de los medios de cultivo se disolvieron todos los compuestos y se distribuyeron en alícuotas de 40 ml cada uno, para la asimilación de carbonos y en alícuotas de 20 ml para la asimilación de nitrógeno; se esterilizaron en autoclave a 20 Lb por 15 min. Para el momento de aplicar la técnica, se diluyeron los medios de cultivo y se mantuvieron a 56°C.

Se preparó el inóculo de la cepa, arrastrando suficiente cantidad de colonias a partir de un cultivo en medio de Sablac de 48 horas de crecimiento a 35°C y se mezcló en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril, con la finalidad de lograr un inóculo grueso o hasta obtener una turbidez de 5 Mac Farland.

Dos (2) ml de este inóculo se vertieron en un tubo que contenía 40 ml del medio para la asimilación de carbonos, se mezcló manualmente y se colocó en una placa de Petri de 18 cm de diámetro. La cantidad de inóculo restante (1 ml), se vertió en el tubo con el medio para la asimilación de nitrógeno, se mezcló manualmente y se colocó en una placa de Petri de 8 cm de diámetro.

Una vez solidificado el medio, se rotuló el fondo de ambas placas de Petri con un número asignado a cada una de las sustancias a evaluar. Las fuentes de carbono a estudiar fueron: sacarosa, maltosa, melibiosa, eritritol, lactosa, galactitol, inositol. El nitrato se utilizó como la fuente nitrogenada a evaluar. Todo lo anterior de acuerdo con Lodder y Rippon [9,10]. La glucosa se utilizó como patrón de referencia de asimilación de la fuente carbonada y la peptona como patrón de referencia de asimilación del compuesto nitrogenado. Se evaluó, así mismo la asimilación de la creatinina, como fuente nitrogenada [9,10,12,13].

Técnica empleada

Se utilizó la técnica de Araujo, la cual es una modificación del método de Beijeringck. Usando una aguja de inoculación previamente esterilizada con un mechero, se humedeció 2 mm de la punta de la misma con agua estéril y, posteriormente, se impregnó dicha punta con cada una de las sustancias a evaluar correspondientes a la fuente carbonada o nitrogenada en estudio. Se introdujo la punta de la aguja perpendicularmente a la superficie del medio de cultivo, en el sitio previamente asignado y rotulado en el fondo de la placa. Este procedimiento se repitió de manera sucesiva para cada una de las sustancias a estudiar (Fig. 1).

Posteriormente, las placas se colocaron, invertidas, en una estufa a 35°C. Cada 24 horas se procedió a la lectura de las mismas, hasta un máximo de 7 días, reportándose la asimilación de las sustancias nitrogenadas y carbonadas, al evidenciarse una zona circular de mayor densidad de crecimiento alrededor del sitio donde se aplicó la sustancia a estudiar en el agar. Dicha lectura fue efectuada por un observador ciego (desconocedor del resultado de algún dato de la investigación realizada) [14].

Prueba de la termotolerancia

Las cepas en estudio se sembraron en medio de Sablac y se sometieron a una temperatura de 37°C, con ayuda de una estufa. Se observaron a las 72 horas, reportando la presencia o ausencia de crecimiento [9,10,12].

Medio de Staib agar modificado

Semillas de Guizotia abyssinica molida 70 g; glucosa 10 g; creatinina 0,78 g; fosfato de potasio KH₂PO₄ 1 g, agar 20 g, agua destilada 1.000 ml [15].

Para la preparación del medio se procedió a cocinar en agua las semillas previamente molidas, hasta que el agua presentó un color amarillo transparente. Luego se pasó por un colador de tela y la solución se colocó en un Beaker. En la misma se diluyeron los demás componentes. Se distribuyeron en alícuotas de 20 ml y se esterilizaron en autoclave a 20 Lb por 15 min. En el momento de aplicar la prueba, se diluyó el medio y se vertió en placas de Petri; se dejó solidificar.

A partir de un cultivo de 48 h de crecimiento a 35°C de Cryptococcus a estudiar, se realizó una siembra en estría sobre la superficie del medio. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente (23-28°C) y se observaron diariamente por un máximo de 1 semana. Se registró la presencia de algún cambio de color de las colonias y/o del medio, a través de un observador ciego (desconocedor del resultado de algún dato de la investigación realizada).

Determinación de la variedad mediante el uso del medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB):

Medio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB): Solución A: Glicina 10 g; fosfato de potasio monobásico KH₂PO₄ 1 g; sulfato de magnesio MgSO₄ 1 g; tiamina-HCl 1 mg; sulfato de L-canavanina 30 mg; agua destilada100 ml; pH 5,6. Se esterilizó por filtración (0,45 m).

Solución B: Azul de bromotimol 0,4 %; agua destilada 100 ml.

Para 1.000 ml del medio: Solución B 20 ml; agua destilada 880 ml; agar 20 g; solución A 100 ml.

Se mezcló la solución B con el agua destilada y el agar. Se esterilizó en autoclave y, al entibiar, se agregó la solución A. Se distribuyó a razón de 4 ml por tubo, dejando solidificar con taco y bisel [16].

A partir de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 35°C en medio de Sablac, se procedió a realizar la siembra en la superficie del bisel. Se dejaron a temperatura ambiente y se observaron diariamente hasta un máximo de 5 días.

Interpretación de los resultados

Color amarillo o amarillo-verdoso: C. neoformans var. neoformans.

Color azul de cobalto: C. neoformans var. gattii.

Estadística

En el presente estudio la técnica aplicada consistió en estadística descriptiva, en donde se usaron tablas de frecuencias, determinación de porcentajes y sensibilidad.

RESULTADOS

Las 26 cepas, procedentes de la micoteca, resultaron pertenecientes a la especie Cryptococcus neoformans según la identificación efectuada con el aparato automatizado MicroScan^® DADE BEHRING

Con relación a la prueba de la ureasa se observó que el 100% (26) de las cepas de Cryptococcus neoformans evaluadas, resultaron ureasa positiva. Esta respuesta a la prueba se observó de manera similar, tanto con el uso del caldo urea de Stuart como con el uso de agar urea de Christensen como prueba patrón, a 35°C y a temperatura ambiente (23-28°C), hecho que demuestra un 100% de sensibilidad del caldo urea de Stuart para ser aplicado en la prueba de la ureasa.

El cambio de color de amarillo a rosado intenso o fucsia de ambos medios de cultivo, que indica hidrólisis de la urea, se apreció entre las 24 horas y 48 horas de observación, con un predominio a las 24 horas, especialmente en las pruebas cuyos medios habían permanecido en estufa a 35°C. No se observó cambio del color del medio después del segundo día.

Al aplicar la prueba de auxanograma en medio sólido con la técnica de Araujo para evaluar la capacidad del microorganismo de utilizar determinadas sustancias como única fuente de carbono, se observó, que un 100% de las cepas (26) asimilaron la maltosa, la sacarosa, el inositol y el galactitol. Ninguna de las 26 cepas estudiadas asimiló lactosa, melibiosa, ni eritritol. Estos resultados se obtuvieron a las 24 horas, permaneciendo sin cambio hasta los 7 días de observación. Al comparar los resultados observados en nuestro estudio con la prueba de auxanograma utilizando el medio de Lodder, aplicado en la técnica de Araujo, se reveló una total concordancia con lo descrito por Lodder y Rippon [9,10], haciendo posible identificar a todas las cepas estudiadas como Cryptococcus neoformans, resultados éstos que se corroboran con los obtenidos por el método de identificación automatizada utilizando el MicroScan^®, demostrándose así que la técnica de Araujo presenta un 100% de sensibilidad, para la identificación de especie.

Con respecto a la capacidad de las levaduras de asimilar determinadas sustancias como fuentes nitrogenadas, se encontró que no hubo asimilación de nitrato por parte del 100% de las cepas estudiadas. En contraste, el 100% de estas cepas asimilaron la creatinina.

En la prueba de la termotolerancia de las cepas, todas las cepas (26) crecieron adecuadamente a 37°C a las 72 horas.

Al evaluar la capacidad de Cryptococcus neoformans para producir la enzima fenoloxidasa sobre el medio de Staib agar modificado, un 84,61% (22) presentaron colonias de color marrón. No obstante, en un 15,39% (4) de las cepas estudiadas las colonias permanecieron de color blanco, esto a pesar de que fueron ureasa-positivas; y se identificaron como Cryptococcus neoformans con la prueba de auxanograma mediante la técnica de Araujo y por el método automatizado de MicroScan^®. Estas 4 cepas provenían de la micoteca, las cuales habían sido conservadas en agua destilada.

DISCUSIÓN

Las cepas de la micoteca evaluadas, mantuvieron su capacidad de asimilar las sustancias que representan las fuentes de carbono y de nitrógeno, al igual que la capacidad de producir la enzima ureasa, indistintamente al número de años sumergidas en el agua destilada, inclusive hasta después de 40 años. Por lo tanto, el método de conservación de Castellani, utilizado por nosotros en la sección, mantuvo nuestras cepas viables y sin alterar estas propiedades bioquímicas, aspecto que destaca la utilidad del método como excelente técnica de conservación de esta levadura, con la ventaja de su bajo costo y simple elaboración [5,17-20].

Es conocido que C. neoformans posee como factores de virulencia la cápsula, la capacidad de crecer a 37°C y la producción de las enzimas ureasa y fenoloxidasa [21-26]. Entre éstos la producción de la enzima fenoloxidasa juega un papel importante, ya que actúa como un antioxidante, contribuyendo a la sobrevida de la levadura dentro del huésped. Además, podría explicar el particular neurotropismo que presenta esta especie, al utilizar las catecolaminas naturales, como la dopamina [22]. Esta fenoloxidasa es la enzima involucrada en el proceso de la melaninogénesis de este hongo en el medio de Staib-agar.

Denning, en 1990, destaca en su estudio que el medio de Staib agar es un medio diferencial para reflejar la capacidad de C. neoformans de producir la enzima fenoloxidasa, con 100% de especificidad y sensibilidad, especialmente si el medio se mantiene a 37°C. Sin embargo, algunos autores reportan la ausencia de pigmento marrón en algunas cepas de C. neoformans [25,27].

Esta pérdida de la capacidad de producir la enzima fenoloxidasa se ha tratado de explicar por diversas razones: a) el efecto del sobrecrecimiento bacteriano, lo que lleva a una fuerte alcalinización del medio, b) por la larga estadía de la levadura dentro del cuerpo humano durante una criptococosis crónica. Esta última razón fue aportada por Staib, al observar que después de 25 años de experiencia utilizando el medio a base de semillas de Guizotia abyssinica y creatinina para el aislamiento de C. neoformans a partir de muestras clínicas y deyecciones de aves, obtuvo una cepa fenoloxidasa-negativa de una muestra de un paciente inmunocomprometido sin SIDA [14,17,27].

En nuestro estudio, la capacidad de C. neoformans para producir la enzima fenoloxidasa en el medio de Staib agar modificado se reflejó en el 84,61% (22) de las cepas evaluadas, por el crecimiento de colonias marrones. El 15,39% (4) de las cepas de C. neoformans restantes formaron colonias de color blanco; éstas provenían de la micoteca, y habían sido mantenidas en agua destilada, una cepa por 19 años, dos por 17 y una por 4 años.

Estas 4 cepas podrían haber perdido uno de los factores de virulencia, como es la capacidad de producir la enzima fenoloxidasa y, en consecuencia, la capacidad neurotrópica de esta especie, manifestado por este fenómeno fenotípico, aspecto que podría ser estudiado en un futuro, evaluando el comportamiento in vivo de estas cepas que produjeron las colonias de color blanco en animales de experimentación, comparando las mismas con el resto de las cepas que se presentaron como colonias de color marrón [21-24]. También podríamos especular que la falta de producción de melanina fuese una característica fenotípica particular de estas 4 cepas.

En este trabajo concluimos que, indistintamente al número de años sumergidas en el agua destilada, las cepas estudiadas procedentes de la micoteca de la Sección de Micología Médica, mantenidas por el método de Castellani, conservaron su viabilidad, sin alterar su capacidad de producir la enzima ureasa y de asimilar las fuentes carbonadas y nitrogenadas. Sin embargo, en 4 cepas de las mismas se observó la falta de producción de la enzima feniloxidasa, lo que se evidenció con el desarrollo de colonias de color blanco en el medio de Staib agar modificado; no sabemos si esta característica fenotípica es inherente a la naturaleza de las cepas o que éstas perdieron la capacidad de producir la enzima por el tiempo que estuvieron en agua destilada, debido a que no fueron originalmente sembradas en el medio de Staib agar modificado.

Sabemos que utilizando el método de liofilización (2), se asegura un alto porcentaje de viabilidad para la mayoría de los hongos. Sin embargo, el método de Castellani modificado es extremadamente fácil, económico y satisfactorio para la preservación de los mismos, si se realiza con la técnica correcta; esto es, cepa en perfecto estado, riguroso control de calidad para su pureza, inóculo suficientemente grande, tapa de baquelita hermética y extremar las medidas de asepsia, para evitar la contaminación de las cepas en el momento del repique.

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