Aplicación de la técnica de separación inmunomagnética para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7 en muestras de leche.

Luigi-Sandoval T.

Trabajo de ascenso presentado como requisito para optar a la categoría de Profesor Asistente en el escalafón universitario. Facultad de Ciencias de la Salud, Escuela de Bioanálisis, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.

RESUMEN

Se estudió la aplicación de la técnica de Separación Inmunomagnética (IMS) previa al cultivo estándar en Mac Conkey-Sorbitol (MK-S), para detectar E. coli O157:H7 en leche y determinar la influencia de dilución de muestras, tiempo de incubación, número de lavados y volumen de inmunoperlas sobre el crecimiento de E. coli O157: H7 en MK-S post-inmunocaptura. El tiempo de incubación y volumen de inmunoperlas  no resultaron determinantes al aplicar la técnica con  leche UHT y cruda. Con el factor de dilución de las muestras y el número de lavados sí existieron diferencias en la recuperación de microorganismos. La IMS previa al cultivo en MK-S es una técnica eficaz, rápida y de fácil aplicación para detectar E. coli O157:H7 en leche. En leche cruda se recomienda realizar 4 diluciones seriadas y al menos 4 lavados. La IMS, acompañada de siembra en MK-S, permite identificar E. coli O157: H7 en leche en 18 horas.

Palabras-clave: Separación inmunomagnética, Microbiología, métodos rápidos, Escherichia coli O157:H7.

Application of the immunomagnetic separation technique for Escherichia coli O157:H7 isolation in milk samples.

SUMMARY

The application of Immunomagnetic Separation (IMS) technique, previous to the standard culture in Mac Conkey-Sorbitol (MK-S), was studied to detect E. coli O157:H7 in milk and to determine the influence of samples dilution, incubation time, number of washings and immunobeads volume, over the growth of E. coli O157:H7 on MK-S post-immunoseparation. Incubation time and immunobeads volume were not determinant when applying the technique with UHT and crude milk. It was found differences in the recovery of microorganisms when applying samples dilution factor and number of washings. The previous IMS to the culture on MK-S, is an effective, fast, and easy application technique to detect E. coli O157:H7 in milk. It is recommended to make 4 dilutions and at least 4 washings in crude milk. The IMS accompanied by MK-S seeding allows milk identification of E. coli O157:H7 in 18 hours.

Key-words: Immunomagnetic separation, microbiology, rapid tests, Escherichia coli O157:H7

INTRODUCCIÓN

Se entiende por enfermedades transmitidas por alimentos cualquier síndrome originado por la ingestión de productos alimenticios y agua que contengan agentes etiológicos o metabolitos producidos por ellos, en cantidades tales que afecten la salud del consumidor, a nivel individual y de grupos de población (1). La diseminación de estas enfermedades se relaciona principalmente con el consumo de alimentos de origen animal como carnes y productos lácteos. La introducción de medidas de higiene y salud pública en la producción de productos cárnicos, así como la introducción de procesos de pasteurización en la industria láctea, disminuyeron la incidencia de tales enfermedades en los países desarrollados, no así, en los países en vías de desarrollo, en donde las condiciones de higiene dentro de este tipo de industria son bastantes deficientes. Sin embargo, en la actualidad las tendencias de los consumidores al preferir productos “naturales” han hecho que el problema de las enfermedades transmitidas por los alimentos resurja en los países desarrollados y se complique más en los del tercer mundo (2).

En el caso de la leche y sus derivados, los problemas relacionados con la transmisión de enfermedades infecciosas son menores cuando la población consume los productos pasteurizados o sometidos a algún procedimiento térmico. Sin embargo, en Venezuela, especialmente en las áreas rurales, donde prevalecen condiciones socioeconómicas precarias y existe una ausencia de hábitos de higiene, la población consume en su mayoría leche y productos lácteos sin ningún tipo de tratamiento térmico, por lo que el riesgo de contraer infecciones microbianas es alto (3). La leche, además de ser un medio nutritivo para el hombre y los animales, es también un medio favorable, desde el punto de vista físico y químico, para la multiplicación de microorganismos y es factible de contaminación por un amplio espectro de bacterias patógenas para el hombre (4).

Entre estos microorganismos encontramos a E. coli cepa O157:H7, bacteria de interés en productos lácteos. Los recientes avances en biotecnología están superando rápidamente los procedimientos diagnósticos usados en el análisis microbiológico de los alimentos. Sin embargo, los alimentos presentan retos únicos a la aplicación de estas técnicas, debido a su complejidad y variedad, su interferencia en los métodos de detección rápida y la necesidad de detectar bacterias patógenas cuando están presentes en los alimentos en muy bajos niveles. Los métodos para secuestrar patógenos de los componentes de los alimentos que interfieren y concentrarlos en pequeños volúmenes son necesarios, para permitir la eficiente aplicación de métodos rápidos de detección e identificación (5), especialmente cuando se trata de microorganismos reconocidos como causantes de enfermedad diarréica humana, como E. coli O157:H7, ya que su presencia en alimentos representa un riesgo potencial para la salud, por causar diarrea sanguinolenta y producir complicaciones como Colítis Hemorrágica (HC), Síndrome Hemolítico Urémico (HUS) y Púrpura Trombocitopénica Trombótica (TTP).

Los métodos de cultivo estándar para la detección de E. coli O157:H7 son laboriosos; generalmente incluyen un pre-enriquecimiento, seguido por un enriquecimiento selectivo y confirmación bioquímica. El método completo puede tomar días o semanas. Los aislados  necesitan ser confirmados serológicamente con antisueros O157 y H7. Algunas metodologías implican mantenimiento de cultivos tisulares, protocolos complicados, empleo de equipos especializados y requieren de condiciones especiales para ser implementadas en laboratorios de rutina microbiológica, por lo que se necesita implementar nuevos métodos de detección rápida, sensibles y específicos para su aislamiento a partir de alimentos, que además de acortar el tiempo de análisis disminuya los costos. Entre estos métodos se encuentra la técnica de Separación Inmunomagnética (IMS), la cual se basa en el hecho de que las bacterias inmunológicamente unidas a  partículas magnéticas, generalmente resultan viables y pueden continuar su multiplicación si se les provee los requisitos nutricionales.

Esta tecnología  podría facilitar el aislamiento de patógenos que se encuentren en bajas concentraciones en muestras de alimentos; además, es rápida, específica y de bajo costo. Tomando en consideración todo lo expresado anteriormente, y dado que en Venezuela no se ha reportado la aplicación de la IMS a muestras de leche, en el presente trabajo se aplicó la técnica de Separación Inmunomagnética, previa al cultivo estándar en MacConkey-Sorbitol (MK-S), para detectar E. coli O157: H7 en muestras de leche. Se determinó la influencia del tiempo de incubación (o de reacción inmunológica), del  número de lavados, volumen de inmunoperlas y la dilución de la muestra sobre el crecimiento de E. coli O157:H7 durante la aplicación de la Técnica de Separación Inmunomagnética, estableciendo así un protocolo de fácil implementación en laboratorios de rutina de análisis microbiológico de alimentos en nuestro país.

MATERIALES Y MÉTODOS

Leche: La leche completa reconstituida enriquecida con calcio y vitaminas (esterilizada UHT: Ultra High Temperature) se contaminó artificialmente en el laboratorio con el microorganismo E. coli O157:H7. Se seleccionó este tipo de leche debido a que es sometida a un tratamiento térmico de 150°C por 2 ó 3 segundos y luego envasada asépticamente, razón por la cual consideramos el tipo de leche más idóneo para estandarizar la técnica sin interferencia de flora contaminante.

Cepa empleada: La cepa de E. coli O157:H7 empleada pertenece a la colección del Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Cátedra de Ambiental de la Universidad Simón Bolívar (Caracas). Fue suministrada por el Prof. Tomás Rojas, del Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carabobo. La cepa se mantuvo y repicó en cuñas de Agar BHI (infusión cerebro corazón). Se reactivó 24 horas previas a cada ensayo en caldo BHI.

Medios de cultivo: Agar plate count, agar MacConkey, agar eosina azul de metileno, agar MacConkey-Sorbitol.

Perlas: Las perlas paramagnéticas (Dynabeads anti-E. coli O157) fueron obtenidas comercialmente conjugadas a anticuerpos anti- E. coli O157 purificados y adsorbidos  y covalentemente unidos a la superficie. Las inmunoperlas estaban suspendidas en PBS (solución búffer fosfato) pH 7,4, con 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) y 0,02% de azida de sodio (NaN3). Fueron alicuotadas en tubos Eppendorf estériles y almacenadas a 4°C antes de su uso. Se siguieron las recomendaciones del fabricante para su aplicación (Dynal Inc, USA).

FASE I: PRELIMINAR A LA INMUNOCAPTURA.

Reactivación de la cepa de E. coli O157:H7: A partir de cuñas de conservación de agar BHI, conteniendo un cultivo de la cepa, se inoculó una asada en un tubo de ensayo con caldo BHI, el cual se dejó a temperatura ambiente por 24 horas. También se repicó para conservación a temperatura ambiente en agar BHI semisólido.

Viabilidad de E. coli O157: H7 en leche UHT: Se inoculó 1 ml del cultivo bacteriano reactivado de 24 horas en un envase de 250 ml de leche UHT. Se mezcló ligeramente y se dejó incubando a 37°C por 48 horas. Una vez transcurrida la incubación, se sembró en agar MacConkey y agar eosina azul de metileno. Se incubaron las placas por 24 horas a 37°C, observándose la formación de colonias típicas de E. coli.

Confirmación bioquímica de E. coli O157:H7: Se realizó en el Laboratorio Clínico “César Sánchez Font” de la Clínica “Guerra Méndez” en la ciudad de Valencia. Se realizó la bioquímica tanto al cultivo puro como a colonias aisladas post-incubación en leche UHT por medio de MicroScan (autoSCAN 4, DADE Behring, Lab. Weiss, C.A.). Se realizó la confirmación bioquímica y serológica de E. coli O157:H7 con antisuero específico a O157 y con siembra en MK-Sorbitol, para observar la no fermentación del sorbitol, propiedad  que corresponde a la cepa O157:H7.

Control de esterilidad de la leche UHT: Se incubaron 5 envases de cada lote de muestra empleado a 37°C  por 7 días. Posteriormente se sembró 0,1 ml de cada muestra estudiada en placas de agar plate count, agar MacConkey y agar eosina azul de metileno. Se incubaron por 24 horas a 37°C y se cuantificó el número de colonias crecidas (6).

Determinación de la cantidad del inóculo a emplear en la contaminación artificial de la leche UHT: Para determinar la cantidad de inóculo de  E. coli O157:H7 utilizado para contaminar artificialmente la leche, se utilizó la técnica del recuento en placa, luego de diluir una muestra del cultivo puro. Con cada inóculo se observó la cantidad de colonias crecidas en los medios de cultivo, hasta obtener el menor crecimiento posible detectable en placas, para luego comparar el crecimiento del mismo inóculo después de aplicada la técnica de inmunocaptura.

FASE II: APLICACION DE LA TECNICA DE CAPTURA INMUNOMAGNETICA EN LECHE U. H. T.

Control de conjugación de las perlas. Aglutinación: En una lámina para aglutinación se colocaron 40 µl de la solución de perlas inmunomagnéticas (anti-E. coli O157:H7), 40 µl de PBS pH 7,2 y se mezcló con 20 µl del cultivo puro de E. coli O157:H7. Se dejó reaccionar por un minuto y se observaron los granos de precipitación a simple vista y al microscopio óptico con objetivos de 10x y 40x. La muestra control, la cual consistió de 40 µl de la solución de inmunoperlas anti-E. coli O157, fue sometida al mismo procedimiento sin agregar los 20 µl del cultivo bacteriano.

Siembra de inmunoconjugados: Se sembraron 50 µl de la solución de perlas inmunomagnéticas (anti-E. coli O157:H7), tanto puro como diluido en PBS en proporción 1:1, y se sembraron en placas de agar MacConkey y agar eosina azul de metileno. Se incubaron a 37°C por 48 horas.  

Procedimiento de estandarización de la técnica en leche UHT: En condiciones asépticas en el laboratorio se contaminaron muestras de leches esterilizadas UHT. (250 ml), con 10 µl de un cultivo puro de E. coli O157:H7. Este volumen fue predeterminado en la fase I de la metodología. Seguidamente se colocaron 20 µl de Dynabeads, previamente agitado (vórtex), en tubos Eppendorf estériles sujetos al mismo con cinta adhesiva. Se añadió 1 ml de la muestra de leche contaminada artificialmente con una suspensión de un cultivo puro de 24 horas de E. coli O157:H7. Se colocaron las muestras en el vórtex muy bien tapadas y se agitaron por 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se dejaron en reposo por 2 a 3 minutos. Con el magneto concentrador colocado, se invirtieron varias veces (al menos 10) los tubos lentamente. Se abrieron los tubos y se sacó el líquido, evitando tocar las paredes de los mismos; se aspiró cuidadosamente. Removiendo el magneto concentrador (barra magnética), se agregó 1 ml de PBS pH 7,2. Se invirtieron los tubos 6 ó 7 veces lentamente en el soporte. Se introdujo de nuevo el magneto concentrador, dejando en reposo 2 a 3 minutos. Se invirtieron nuevamente 6 ó 7 veces los tubos lentamente en el soporte (con el magneto) y se aspiró el buffer del lavado (evitando tocar las paredes) con pipetas Pasteur estériles.

Los lavados se repitieron 2 veces más. Se retiró el magneto y se resuspendió en 100 µl de PBS. Una vez efectuada la inmunocaptura, se sembraron las inmunoperlas en los medios de cultivo agar MacConkey y agar Mac Conkey-Sorbitol, distribuyendo los 100 µl del sobrenadante resultante del último lavado, entre las 2 placas de medios a usar. La muestra se colocó en la placa en un punto seleccionado, de donde se pudo esparcir con un hisopo estéril y luego con un asa de platino en estría. Las placas fueron incubadas a 37°C por 24 horas.

Identificación: Una vez transcurridas 24 horas de incubación, se les realizó a las colonias la coloración de Gram y se sometieron a la consiguiente identificación: MicroScan (auto SCAN 4, DADE Behring, Lab. Weiss, C.A.), empleado para la identificación bioquímica. En cuanto al serotipo, la IMS de captura de E. coli O157, especificidad debida al anticuerpo anti-E. coli O157 (Dynal, INC.), el cual está conjugado a las inmunoperlas y con el posterior crecimiento de colonias incoloras en MK-S, confirmamos que la cepa pertenece a una E. coli O157:H7, ya que es sabido que esta serovariedad posee una propiedad bioquímica (no fermenta sorbitol) que las distingue de otras cepas de E. coli de la flora normal, lo que facilita su recuperación en el laboratorio clínico (7).

Variables del sistema de inmunocaptura.

A. Tiempo de reacción inmunológica (incubación): Se ensayaron muestras de leche contaminadas con E. coli O157:H7 aplicando el protocolo antes esbozado a diferentes tiempos de incubación a temperatura ambiente, con agitación continua. Se efectuó la técnica a 5, 10, 30 y 60 minutos de incubación.

B. Número de lavados: El número de lavados se varió para observar los resultados en el crecimiento bacteriano después de realizar la inmunocaptura, al aumentar o disminuir los lavados, manteniendo constantes los demás parámetros del protocolo, inclusive el volumen de los lavados (1 ml). Se realizaron 2, 3, 4 y 5 lavados con PBS en procedimientos por separado.

C. Volumen de inmunoperlas anti-E. coli O157 (Dynal): Para determinar el volumen de inmunoperlas anti- E. coli O157 (Dynal) se procedió a realizar el mismo procedimiento de inmunocaptura con diferentes volúmenes. Se ensayaron volúmenes de 10, 20 y 30 µl de la suspensión de inmunoperlas (perlas unidas a los anticuerpos anti- E. coli O157). 

D. Dilución de la muestra de leche: Se llevó a cabo la técnica de captura inmunomagnética partiendo de la muestra total o completa de leche UHT contaminada con 10 µl de cultivo puro de E. coli O157:H7 y, por otra parte, se ensayó con una dilución de esta muestra l:10 en agua peptonada al 1%, para analizar el efecto de la dilución de la muestra en los resultados.

Controles del sistema: Se procedió a aplicar la técnica de captura inmunomagnética a las siguientes muestras: Solución buffer fosfato (PBS), leche UHT sin contaminar (“esterilizada”), cultivo puro de E. coli O157:H7 en caldo BHI, cultivo puro de E. coli O157:H7 en PBS, cultivo puro de E. coli silvestre en PBS, leche UHT contaminada con E. coli silvestre, suspensión de anticuerpos monoclonales anti-E. coli O157.

Comparación de la técnica de separación inmunomagnética con el método de cultivo estándar: La comparación de ambas técnicas se realizó cualitativamente mediante el crecimiento de E. coli O157 presente en muestras de leche UHT contaminadas artificialmente. A un grupo de muestras se les aplicó el procedimiento de inmunocaptura previo a la siembra en placas y a otro grupo se le aplicó la siembra directamente a las placas, con medios de cultivo agar Mac Conkey y agar Mac Conkey-Sorbitol. En el método de cultivo estándar el volumen de la muestra sembrado en superficie fue de 0,1 ml, proveniente de una muestra de 250 ml contaminada con 10 µl del cultivo puro de E. coli O157, mientras que para el método de IMS el volumen de muestra empleado fue de 1 ml. Al finalizar el procedimiento de IMS se sembró en los medios de cultivo 50 µl de la suspensión  resultante de inmunoperlas.

FASE III: APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE CAPTURA INMUNOMAGNÉTICA A LA LECHE CRUDA.

Se utilizó una muestra de leche cruda recién ordeñada, contaminada artificialmente en el laboratorio con el microorganismo objeto de este estudio (E. coli O157:H7). La recolección de la muestra se hizo bajo las mismas condiciones utilizadas normalmente en la rutina del trabajo diario de la finca. 

Evaluación de la calidad microbiologica de la leche empleada: Tiempo de reducción del azul de metileno (TRAM) (8) y determinación de bacterias aerobias mesófilas (contaje en placa, método estándar) (9).

Procedimiento de captura inmunomagnética: Se procedió a aplicar el protocolo de inmunocaptura estandarizado en la fase II del trabajo a una muestra de leche cruda contaminada artificialmente con E. coli O157:H7, de la misma manera como se realizó con la leche UHT.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El mejoramiento de la calidad de la leche y sus derivados, así como los aspectos relacionados con el mercado de lácteos constituyen, según varios autores, un problema de gran magnitud, en especial para los países del Tercer Mundo y, por ende, para Venezuela, donde no se aplican adecuados estándares de higiene en la recolección y procesamiento de la leche, así como la fabricación de sus derivados.

Según Díaz y col., 1994 (10), cuando la leche cruda es de mala calidad microbiológica, aún cuando se apliquen procesos de higienización, se puede correr el riesgo de accidentes indeseables en la elaboración de productos diversos, con las consiguientes pérdidas económicas, así como la posibilidad de encontrar patógenos en el producto final, que pongan en riesgo la salud del consumidor. Existen métodos rápidos para la detección de microorganismos en alimentos.

Los métodos rápidos se caracterizan por tener un sistema de detección rápido, pero el procesamiento de la muestra suele ser igual de laborioso que para un método microbiológico clásico; sin embargo, presentan ciertas limitaciones: la concentración de los microorganismos es, por lo general, muy baja; el crecimiento de las bacterias no se puede acelerar significativamente y las matrices de alimentos son muy complejas e implican un “estrés” de procesamiento para el microorganismo. Es importante la viabilidad real del microorganismo contaminante, pues de eso depende su potencial de daño al alimento o al consumidor. Estas limitaciones logran solventarse con el uso de la Técnica de Separación Inmunomagnética.  En Venezuela dicha técnica es empleada sólo en algunos laboratorios de investigación de empresas privadas. La Técnica de Separación Inmunomagnética no había sido aplicada  en nuestro país para detección de microorganismos en muestras de leche, siendo por lo tanto el objetivo principal del presente trabajo, un aporte a la industria alimentaria, especialmente la láctea, que en Venezuela aún tiene una amplia posibilidad de desarrollo.

En cuanto a la presente investigación, vemos que el procedimiento de estandarización de la técnica de separación inmunomagnética aplicado en leche UHT y en leche cruda para detectar E. coli O157:H7 estuvo basado en el protocolo sugerido por la casa comercial Dynal, Inc. Partiendo de éste, se realizaron algunos cambios, observando el comportamiento de la técnica al estudiar la influencia de ciertas variables. La primera variable fue el Tiempo de Reacción Inmunológica o Tiempo de Incubación. Con respecto a éste se pudo observar que los resultados, expresados cualitativamente en crecimiento bacteriano a diferentes tiempos de incubación (5, 10, 30 y 60 minutos) a temperatura ambiente y agitación en vórtex, fueron muy similares, es decir, agitando la muestra con las inmunoperlas por 5 minutos se obtenía un crecimiento moderado del microorganismo, mientras que con 60 minutos de incubación el crecimiento era ligeramente mayor; pero la diferencia fue realmente mínima.

Se decidió trabajar con un protocolo estandarizado a 10 minutos a temperatura ambiente con agitación continua en vórtex, tiempo que se consideró suficiente como para que se diera la formación de suficientes inmunocomplejos (Tabla 1). Esta apreciación coincide con la de otros autores (11), quienes trabajaron con un protocolo estandarizado a 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, con agitación continua, en la captura del antígeno K88 de E. coli. Este tiempo fue sugerido como óptimo para concentrar suficientes microorganismos presentes en la muestra a analizar. Sin embargo, en otras investigaciones (12, 13) se utilizan, en sus protocolos de experimentación, tiempos de incubación que difieren al antes mencionado: por ejemplo, 15 minutos con agitación ocasional a 20°C.

Tabla 1. Relación entre el tiempo de incubación y el crecimiento de E. coli O157:H7 post-inmunoseparación magnética en muestras de leche UHT.

     +++: 100 UFC

También se ha recomendado un tiempo de incubación de 15 minutos, pero con agitación continua, a temperatura ambiente (14, 15). En la literatura encontramos reportes que han obtenido buenos resultados al aplicar la técnica de inmunoseparación con mayor tiempo de incubación, que sugieren 60 minutos de incubación a una temperatura de 4°C (16). El mismo tiempo es recomendado por otros investigadores (17, 18), aunque a temperatura de 20 a 22°C. Sin embargo, se debe tomar en cuenta que si se dejan mucho tiempo en suspensión antígenos y anticuerpos, puede aumentar la posibilidad de uniones inespecíficas, que alterarían la especificidad de la técnica. Otros autores (19-21), sugieren un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente y con agitación continua, de suave a moderada, mientras que en otro estudio (22) se recomiendan 20 minutos a 4°C con agitación suave cada 5 minutos.

Como se puede apreciar, existe una amplia variabilidad de criterios en cuanto al tiempo y temperatura de incubación se refiere; sin embargo, se debe tomar en cuenta que estos ensayos han sido estandarizados en diferentes muestras, para concentrar o detectar diferentes células o microorganismos; por eso es recomendable que antes de trabajar con la técnica de IMS se establezcan condiciones de trabajo específicas a cada ensayo, dependiendo también, entre otras cosas, del microorganismo a detectar, la muestra donde se encuentre y, por ende, del propósito planteado en la investigación. La segunda variable analizada fue la influencia del número de lavados en la obtención de mejores resultados. Como se explicó en la metodología, se ensayaron desde 2 hasta 5 lavados, con duración de 3 minutos cada uno y a temperatura ambiente. En el presente trabajo, el número de lavados no resultó determinante cuando se estandarizó la técnica con la leche UHT, ya que los resultados obtenidos fueron casi idénticos en cuanto a recuperación del microorganismo en los medios de cultivos, por lo que se optó por efectuar tres lavados de 3 minutos cada uno y así trabajar con el valor promedio del número de lavados analizados (Tabla 2). Los resultados obtenidos coinciden con otros trabajos de investigación (13-15, 18), donde se ha empleado el mismo número de lavados con excelentes resultados.

Tabla 2. Relación entre el número de lavados en tiempo de 3 minutos al aplicar la inmunoseparación magnética y el crecimiento de E. coli O157:H7 en muestras de leche UHT.

        +++: > 100 UFC

Al comparar estos resultados con los obtenidos por otros grupos de trabajo, se pudo observar que también esta variable goza de amplia variabilidad en los protocolos consultados. Algunos investigadores (11, 17) sugieren someter la muestra, después del proceso de incubación con las inmunoperlas o inmunoseparación, a 4 lavados de 10 minutos cada uno a temperatura ambiente, mientras que hay quienes, por el contrario, sugieren 2 lavados al aplicar la técnica. En la literatura también se cita a autores (20, 21) que, al desarrollar la técnica, sólo realizan un paso de lavado, e inclusive se ha sugerido adicionar al buffer de lavado (PBS) un reactivo de bloqueo (21).

En general, se considera que tres lavados son suficientes al trabajar con leche UHT. Sin embargo, es importante mencionar que cuando la muestra a analizar sea leche cruda, se aumente a 4 ó 5 el número de lavados, debido principalmente a la cantidad de flora contaminante que puede estar presente en la muestra, actuando de manera competitiva en la reacción inmunológica, razón por la cual se recomienda para este tipo de muestra la realización de suficientes lavados, con la finalidad de evitar uniones inespecíficas con dicha flora, además de las posibles interferencias de los componentes de la leche, en especial la grasa, en el crecimiento de los microorganismos, posterior a la inmunocaptura, en los medios de cultivo, e inclusive obtener resultados falsos positivos.

En cuanto al volumen de inmunoperlas a utilizar durante la técnica, se consideraron los siguientes: 10, 20 y 30 µl, arrojando mejores resultados cualitativos el uso de 30 µl, aunque con 10 µl los resultados fueron bastante aceptables, lo que nos indica que se puede usar este volumen de trabajo en caso de contar con pocos recursos y se requiera economizar reactivos. De hecho, se ha reportado en otro trabajo la sugerencia de este volumen para la técnica (12). En el presente trabajo se empleó el volumen intermedio, 20 µl, obteniendo abundante crecimiento bacteriano, post-inmunocaptura, en los medios de cultivo, por lo que se recomienda como volumen ideal (Tabla 3), coincidiendo con lo planteado por otro autor (16).

Tabla 3. Influencia del volumen de inmunoperlas (anti-E. coli O157:H7) empleado al aplicar la inmunoseparació0n magnética y el crecimiento de E. coli O157:H7 en muestras de leche UHT.

   ++: < 100 UFC; +++: >100 UFC

Considerando que en la metodología del análisis de la calidad microbiologica de la leche (cruda, pasteurizada, en polvo, etc.) se realizan diluciones de la misma en agua peptonada al 0,1 ó 1%, se decidió efectuar el procedimiento de captura inmunomagnética a la leche UHT contaminada y posteriormente sometida a diluciones seriadas en proporción 1:10, para confrontar los resultados con los de la leche UHT sin diluir, arrojando crecimientos bacterianos con diferencias casi imperceptibles en los medios de cultivo (Tabla 4). Esto sugiere que, en  caso de analizar leche UHT o leche pasteurizada, se puede trabajar sin diluir la muestra. Caso contrario sucedió con la muestra de leche cruda, contaminada también artificialmente, donde la dilución de la muestra sí influyó en los resultados obtenidos. Los resultados del procedimiento de estandarización de la técnica de captura inmunomagnética aplicado en leche UHT pueden ser transpolables a la leche pasteurizada debido a las características intrínsecas del producto en mención., aún cuando no se sometió a procesamiento este tipo de leche.

Tabla 4. Influencia de las diluciones de la muestra de leche UHT sobre el crecimiento de E. coli O157:H7 post-inmunoseparación magnética. 

   Sd: Sin diluir; ++: < 100 UFC; +++: > 100 UFC

Al analizar los controles del sistema, se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 5): La solución buffer fosfato, aunque fue preparada adecuadamente, no deja de correr el riesgo de una posible contaminación en el laboratorio. Al someter la PBS a la técnica no se observó crecimiento bacteriano en los medios de cultivo, lo que confirmó la esterilidad y no interferencia de este buffer durante el desarrollo del protocolo. Iguales resultados se obtuvieron al someter a ensayo la  leche UHT sin contaminar. Es necesario realizar estos controles cada vez que se monta la técnica, debido a que debemos respaldar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Tanto en el cultivo puro de E. coli O157:H7 en caldo BHI, como en el cultivo puro en PBS y en la muestra de leche, se observó crecimiento abundante del microorganismo post-inmunocaptura; pero se ha de mencionar que en la leche el crecimiento fue ligeramente superior, comportamiento que era de esperarse al observar que, cuando se realizaron los lavados, el botón formado por las perlas agrupadas por el magneto concentrador era de mayor tamaño y, por supuesto, el color lo hacía más evidente a simple vista en los tubos Eppendorf, observación ésta que se correlacionó con el abundante crecimiento en los medios de cultivo.

Tabla 5. Controles del sistema implementados al aplicar la inmunoseparación magnética a muestras de leche UHT.

           (-): No detectadas; +: < 10 UFC; ++: 10-100 UFC; +++: > 100 UFC

Estos resultados quizá sean debidos a que en los 10 minutos que se dejan en reposo las muestras, una vez inoculadas o contaminadas con los 10 µl del cultivo puro de E. coli O157:H7, la multiplicación sea mayor en el sustrato más favorable, en este caso la leche. Otro factor que puede haber influido posiblemente sea la caseína, componente proteico importante, el cual estabiliza mejor la reacción antígeno-anticuerpo y, por ende, se observa mejor el crecimiento bacteriano. Algunos autores (18, 23-27) han recomendado el empleo de buffer fosfato adicionado con seroalbúmina bovina, tween 20 y/o caseína, esto con la finalidad de mejorar, en lo posible, las condiciones del “ambiente” que favorezcan la reacción inmunológica entre el antígeno a capturar y el anticuerpo o inmunoglobulina específica al mismo. Sin embargo, cuando trabajamos en la detección de microorganismos patógenos como E. coli O157:H7 en muestras de leche, no se requiere el uso de PBS adicionado con otros reactivos o componentes. En cuanto al cultivo puro de E. coli silvestre en PBS y en leche UHT contaminada con dicho microorganismo, se pudo observar que la cepa de E. coli salvaje creció escasamente en placas de agar Mac Conkey (MK) y agar MK (A-MK)-sorbitol. En éste último, las colonias se observaron de menor tamaño, planas y menos viscosas que las crecidas en A-MK, debido quizás a que la fuente de carbono (sorbitol) no es la más idónea para su crecimiento, como sí lo es la lactosa presente en el medio Mac Conkey original. Estos resultados, obtenidos al realizar 3 lavados post-incubación, no fueron los esperados, debido a que en los medios de cultivo no se debería observar crecimiento, a menos que el microorganismo presente en la muestra fuese E. coli O157:H7.  

Sin embargo, al realizar un control de conjugación con la cepa de E. coli silvestre y el anticuerpo anti-E. coli O157: H7 (Dynal), no se observó formación alguna de gránulos de precipitación, indicando que el anticuerpo es específico sólo para cepas O157, por lo que se sugiere aumentar a 4 el número de lavados, ya que los resultados reflejaron que 3 lavados no fueron suficientes para eliminar por completo la E. coli silvestre del sobrenadante resultante después de la inmunoseparación. Estas observaciones son de gran importancia, dado que confirman la especificidad de las inmunoperlas empleadas (Dynal, Inc.), es decir, del anticuerpo monoclonal anti-E. coli O157 conjugado a las perlas magnéticas. Al sembrar la muestra que contenía sólo la suspensión de anticuerpos monoclonales anti-E. coli O157 (Dynal, Inc.) no se observó crecimiento alguno; esta muestra  funcionó como uno de los controles negativos.

COMPARACIÓN DE LA TECNICA DE CAPTURA INMUNOMAGNÉTICA CON EL MÉTODO DE CULTIVO ESTÁNDAR

La comparación de ambas técnicas se realizó mediante la cuantificación del crecimiento de E. coli O157:H7 presente en muestras de leche UHT contaminadas artificialmente. A un grupo de muestras se les aplicó el procedimiento de inmunocaptura previo a la siembra en placas y a otro grupo la siembra directamente a las placas con medios de cultivo agar Mac Conkey y agar Mac Conkey-sorbitol. El número promedio de UFC/ml de las muestras de leche del primer grupo fue de 3,5 x 102, mientras que en el segundo grupo se cuantificaron 6,1 x 102 UFC/ml. Según estos resultados, podríamos afirmar que la recuperación de E. coli O157:H7 a partir de las muestras de leche UHT contaminadas fue muy similar en ambas metodologías, deduciendo entonces que, aplicando la siembra directa sin el paso previo de inmunocaptura, los resultados no variarían significativamente; sin embargo, se debe tener presente que el objetivo principal de la IMS es el de capturar el microorganismo blanco y concentrarlo en pequeños volúmenes, con la finalidad de detectar microorganismos que se encuentren en bajas concentraciones en la muestra, y así evitar que patógenos potenciales no sean diagnosticados a tiempo en el laboratorio. Por lo tanto, se debe recordar que en el método de cultivo estándar el volumen de la muestra sembrado en superficie fue de 0,1 ml, proveniente de una muestra de 250 ml contaminada con 10 µl del cultivo puro de E. coli O157:H7, mientras que para el método de IMS, el volumen de muestra sembrado en los medios de cultivo fue 50 ml del sobrenadante resultante post-inmunocaptura. Esto indica que con 50 ml del volumen de muestra sembrada en medios de cultivo se obtuvo un porcentaje de recuperación de microorganismos muy similar al obtenido al emplear la técnica de cultivo estándar, sin previa inmunoseparación, donde la cantidad de muestra sembrada es 0,1 ml, es decir, el doble de lo empleado con la IMS. Estos resultados confirman las ventajas del uso de la IMS como herramienta valiosa en el diagnóstico microbiológico.

Una vez estandarizado el protocolo de inmunocaptura en muestras de leche UHT y analizado los controles de dicho sistema, se procedió a aplicarlo a una muestra de leche cruda recién ordeñada, a la cual paralelamente se le analizó la calidad microbiológica, resultando un número de 7,2 x 104 UFC/ml de bacterias aerobias mesófilas, que según la clasificación de la leche cruda en Venezuela, por la carga microbiana establecida por la norma COVENIN 903-1993, sería clasificada como categoría A, y según la prueba del tiempo de reacción del azul de metileno (TRAM) resultó clasificada como de categoría I (más de 4 horas) (28).

Al aplicar la técnica de IMS a la leche cruda sin diluir y no contaminada no se detectó crecimiento de E. coli O157:H7. Cuando se analizó la leche cruda sin diluir pero contaminada con la cepa de E. coli O157:H7, se obtuvo un crecimiento de colonias incoloras (no fermentadoras de sorbitol) características del microorganismo en estudio; sin embargo un resultado inesperado fue el crecimiento de pequeñas colonias rosadas en MK-S, posiblemente E. coli salvaje u otro microorganismo de la flora contaminante de la leche cruda, aunque el crecimiento estuvo limitado a la periferia de la placa alrededor del abundante crecimiento de E. coli O157:H7. En esta misma muestra contaminada artificialmente pero diluida 1:10 en agua peptonada al 1%, se obtuvo un mejor crecimiento de E. coli O157:H7 en la dilución 10-2, y cabe mencionar que  no se observó el crecimiento de ningún otro tipo de colonia.

El porcentaje de recuperación de E. coli O157: H7 en la dilución 10-2 fue mayor que en la muestra de leche cruda sin diluir, donde la formación del “botón de IMS” fue casi imperceptible, lo que nos sugiere una pérdida de inmunoperlas durante los lavados. No se conoce la razón de la misma, pero se debe suponer que sea posible que los glóbulos de grasa o algún otro componente presente en la leche atrapen gran cantidad de inmunoperlas y éstas se pierdan en los lavados. El crecimiento del microorganismo fue disminuyendo a partir de la dilución 10-3 hasta casi desaparecer por completo en la dilución 10-6 (Tabla  6). Como era de esperarse, en la muestra de leche cruda diluida, los resultados al aplicar la IMS fueron diferentes a los de la muestra de leche UHT diluida, donde la dilución no fue un factor determinante en la recuperación del microorganismo, aunque  al diluir varias veces también disminuía el crecimiento de E. coli O157:H7 hasta desaparecer.

Tabla 6. Relación entre las diluciones de la muestra de leche cruda y el crecimiento de E. coli O157:H7 post-inmunoseparación magnética.

  Sd: Sin diluir; UFC: Unidades formadoras de colonias

En cuanto al crecimiento de otros microorganismo diferentes a E. coli O157:H7, se debe tener presente que, durante la aplicación de la técnica de separación inmunomagnética, en el sobrenadante resultante post-inmunocaptura pueden resultar viables, aunque no conjugadas a las inmunoperlas, cierta cantidad de flora contaminante que no nos interesa detectar, y que su crecimiento en los medios de cultivos indica que se requiere aumentar el número de lavados de la muestra o realizar diluciones de la misma, para así lograr, específicamente, el aislamiento del microorganismo que se desea identificar, que en el caso de la presente investigación fue E. coli O157:H7. Basándonos en los resultados obtenidos, podemos afirmar que es factible la aplicación de IMS a muestras de leche cruda para el diagnóstico rápido de E. coli O157:H7, empleando la IMS previa al método de cultivo estándar con medio MK-S, tomando en consideración que se debe trabajar con al menos 4 diluciones de la muestra, y se recomienda aumentar a 4 el número de lavados.

CONCLUSIONES

1. Es factible la aplicación de la Captura o Separación Inmunomagnética a muestras de leche cruda para el diagnóstico rápido de E. coli O157:H7, empleando la IMS previa al método de cultivo estándar con medio MK-S.

2. Factores como el tiempo de incubación, volumen de inmunoperlas, número de lavados y la dilución de la muestra, empleados durante la IMS, no  influyeron en el porcentaje de recuperación de E. coli O157:H7 en muestras de leche UHT.

3. La dilución de la muestra y el número de lavados son factores importantes a ser considerados cuando se aplica la Separación Inmunomagnética a muestras de leche cruda.

4.  La Técnica de Separación Inmunomagnética, previa al método de cultivo estándar con medio MK-S, permite la identificación de E. coli O157:H7 a partir de una muestra de leche en menos de 18 horas, con relativamente poco material, sin personal técnico muy especializado y en las condiciones de cualquier laboratorio de rutina en Venezuela.

5. Para la detección de E. coli O157:H7 en muestras de leche UHT o pasteurizada, previo al método de cultivo estándar con medio MK-S, se recomienda realizar un protocolo de IMS de 10 minutos de incubación con agitación continua a 3.500 rpm a temperatura ambiente, realizando 3 lavados de 3 minutos cada uno. En este tipo de muestras no se requirió de diluciones durante su procesamiento.

6. Para la detección de E. coli O157:H7 en muestras de leche cruda, previo al método de cultivo estándar con medio MK-S, se recomienda realizar 4 diluciones de la muestra y seguir un protocolo de IMS de 10 minutos de incubación, con agitación continua en vórtex a temperatura ambiente, realizando 4 lavados de 3 minutos cada uno.

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