Actividad inhibitoria de cepas del género Bacillus spp. contra dermatofitos.

Sosa Briceño, M.*; Castillo Colombo, C.**; Scorza, J.***

* Laboratorio de Microbiología. Instituto Médico Valera.

** Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico del Núcleo Universitario “Rafael Rangel”.

*** Centro de Investigaciones “José Witremundo Torrealba”. Núcleo Universitario “Rafael Rangel”, Estado Trujillo, Venezuela.

RESUMEN

Se procesaron muestras de estiércol de animales domésticos, procedentes del Estado Trujillo, para el aislamiento de bacterias esporuladas pertenecientes al género Bacillus, con el objeto de ensayarlas contra dermatofitos y determinar su actividad antifúngica. Un total de 52 cepas de bacterias esporuladas fueron aisladas, de las cuales el mayor número fue en gallinas (19 cepas), seguido de caprinos (12 cepas). De vacunos, equinos y porcinos se aislaron 7 cepas de cada una de las muestras. De los 60 pacientes atendidos por presentar diferentes afecciones de la piel, en la Consulta de Dermatología del Centro de Investigaciones “José Witremundo Torrealba“, del Núcleo Universitario “Rafael Rangel”, de la Universidad de los Andes en Trujillo, se aislaron 3 especies diferentes de dermatofitos: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis. De las 52 cepas del género Bacillus, aisladas en nuestro laboratorio, el 23% (12 cepas) resultaron activas para inhibir el crecimiento de T. mentagrophytes y T. rubrum. Contra M. canis, el 21% (11 cepas aisladas) mostraron actividad inhibitoria. Destacamos que esta actividad antifúngica se produce en medios de cultivo relativamente sencillos y económicos, lo cual sugiere el hallazgo de un nuevo campo de investigación aplicada.

Palabras-clave: Bacillus, dermatofitos, actividad inhibitoria, termoestabilidad, esporulados, antifúngicos

Inhibitory activity of Bacillus spp. against dermatophytes.

ABSTRACT

Samples of domestic animals excrement, coming from Trujillo State, were processed for sporulate bacteria isolation belonging to Bacillus gender, in order to assay them against dermatophytes and to determine their antifungal activity. A total of 52 strains of sporulate bacteria were isolated, which the biggest number was isolated in hens (19 strains), followed by goatishes (12 strains). In bovines, equines and porcines, 7 strains were isolated of each one of the samples. Of 60 patients, attended in the dermatology consulting “José Witremundo Torrealba” Investigations Centre, University Nucleus “Rafael Rangel”, Andes University in Trujillo, to present different affections of the skin, 3 different species from dermatophytes were isolated: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum canis. Of 52 strains of Bacillus gender isolated in our laboratory, 23% (12 strains) were active to inhibit T. mentagrophytes and T. rubrum growth. Against M. canis, 21% (11 isolated strains) showed inhibitory activity. We highlight that this antifungal activity takes place in relatively simple and economic culture media, which suggests the discovery of a new field of applied investigation. 

Key-words: Bacillus, dermatophytes, inhibitory activity, thermostability, sporulate antifungal agents.

INTRODUCCIÓN

El género Bacillus representa un grupo de bacterias Gram positivas. Se caracterizan por ser aerobios estrictos y facultativos. En agar sangre, producen colonias grandes, extensas, entre gris, amarillo pálido, beige y blanco. Algunas especies forman parte de la flora natural en el intestino del humano y algunos animales. Por su ubicuidad en la naturaleza, la mayoría de las especies de Bacillus pueden recuperarse a partir de una variedad de nichos ecológicos (1)

Numerosos trabajos reportan el aislamiento y caracterización de metabolitos antifúngicos provenientes de cepas de Bacillus spp. (2-7). 

Los antibióticos antifúngicos son un pequeño pero significativo grupo de drogas con un importante rol en el control de las enfermedades micóticas. La necesidad de un nuevo, seguro y efectivo antifúngico, es hoy el principal desafío de la industria farmacéutica, especialmente con el aumento de las infecciones oportunistas en pacientes inmunosuprimidos (8). 

En el género Bacillus existen aislados capaces de suprimir el crecimiento fúngico in vivo por la producción de uno o más antimicóticos (3). Los antibióticos producidos in vitro son compuestos responsables del biocontrol in vivo, por cuanto se ha demostrado que algunas cepas productoras de antibióticos son capaces de suprimir enfermedades fúngicas en plantas (9).

Aunque es amplia la información existente en relación con el efecto de los metabolitos aislados del género Bacillus contra hongos patógenos de plantas (2, 6, 9-13), son escasos los reportes de actividad antifúngica contra los dermatofitos causantes de afecciones en humanos.

Entre 1952 y 1956, Texera, Scorza, Tengler y Jordán, en la Escuela de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela, realizaron observaciones no publicadas sobre  aislamientos de cepas de Bacillus  productores de metabolitos antimicóticos (Scorza 2004, Comunicación Personal).

Basándonos en los hallazgos anteriormente explorados, es posible el aislamiento, en muestras de estiércol de animales domésticos, de cepas de bacterias esporuladas con actividad inhibitoria sobre el crecimiento de dermatofitos, aislados de pacientes que acuden a la consulta de Dermatología del Centro de Investigaciones “José Witremundo Torrealba” (JWT) del Núcleo Universitario “Rafael Rangel“, de la Universidad de Los Andes en el Estado Trujillo, Venezuela. 

El presente trabajo fue realizado para aislar cepas del género Bacillus de muestras de estiércol de animales domésticos de diferentes localidades del Estado Trujillo, para investigarlas como fuente natural de agentes con actividad antifúngica contra dermatofitos aislados de lesiones de pacientes.

METODOLOGÍA

AISLAMIENTO DE BACTERIAS ESPORULADAS DEL GÉNERO Bacillus

Muestras de estiércol de animales domésticos, (vacunos, porcinos, caprinos, equinos y gallinas) fueron recolectadas y llevadas al laboratorio, mantenidas a temperatura ambiente en envases separados hasta que estuvieron secas. Luego, se suspendieron 10 gr de cada muestra desecada en 100 ml de agua destilada. Cada una de las suspensiones de estiércol fue pasteurizada durante 20 min a 80 ºC para eliminar los microorganismos no formadores de esporas. Las suspensiones diluidas seriadamente con solución salina y en alícuotas de 0,1 ml fueron sembradas en placas de Petri que contenían 10 ml de agar nutritivo enriquecido con extracto de levadura al 0,3%. Las placas se mantuvieron entre 24 a 48 horas a temperatura ambiente (14). Las colonias fueron descritas macroscópicamente y agrupadas tomando en cuenta su aspecto, consistencia, color, elevación y bordes (Figura 1); seguidamente fueron repicadas en cuñas de agar nutritivo con extracto de levadura al 0,3%.

Las cepas fueron rotuladas de acuerdo a su origen. Las cepas aisladas de gallinas, fueron identificadas como GA₀₁ hasta GA₁₉. Las de vacunos fueron identificados como: VA₀₁ hasta VA₀₇. Las de caprinos CA₀₁-CA₁₂.   Las de porcinos se identificaron como PO01-PO₀₇   y finalmente las de equinos se identificaron como BU₀₁-BU₀₇.

Figura 1. Características macroscópicas de las diferentes colonias de Bacillus spp. aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos.

ENSAYOS IN VITRO  PARA EXPLORAR ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA EN LAS CEPAS DE Bacillus spp. CONTRA LOS DERMATOFITOS.

Cultivo de las cepas de Bacillus spp.: Cada colonia de Bacillus, mantenida en cuñas de agar nutritivo desde su aislamiento, fue sembrada en caldo nutritivo enriquecido con extracto de levadura al 0,3% y se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas. Luego fueron repicadas en placas de agar Müeller-Hinton, utilizando el método del hisopo y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 horas, para luego extraer asépticamente, discos de gelosa de 10 mm de diámetro, a ser ensayados contra los cultivos de dermatofitos.

Preparación de las suspensiones de dermatofitos: Se hicieron suspensiones de dermatofitos aislados en el laboratorio, dispersando trozos de cada uno de los cultivos, en agua destilada estéril, más agitación vigorosa con perlas de vidrio. 

Ensayos in vitro para determinar la actividad antifúngica de las cepas de Bacillus: En placas de Petri estériles se colocaron 5 ml de la suspensión de cada dermatofito y se vertieron sobre ella 10 ml del medio de agar Sabouraud fundido y enfriado a 45°C. Una vez solidificadas las placas, se procedió a colocar sobre el gel los discos de agar conteniendo crecimiento de las cepas de Bacillus. En cada placa de Petri se ensayaron 4 cepas de Bacillus spp. simultáneamente, frente a cada una de las tres especies de dermatofitos. Estas placas fueron incubadas a 25ºC durante 8 días, para determinar la aparición de halos de inhibición alrededor de cada uno de los discos de geles con Bacillus spp. (Figura 2).

Figura 2. Actividad inhibitoria de Bacillus spp. en discos de gel sobre los dermatofitos

RESULTADOS

De las muestras de estiércol de animales domésticos provenientes de diferentes localidades del Estado Trujillo, se aislaron un total de 52 cepas de bacterias esporuladas pertenecientes al género Bacillus, siendo el mayor número de aislados de gallinas (19 cepas), seguido por los de caprinos (12 cepas). De vacunos, equinos y porcinos se aislaron 7 cepas de cada una de las muestras.

De los pacientes atendidos en la Consulta de Dermatología del Centro de Investigaciones “José Witremundo Torrealba” del Núcleo Universitario “Rafael Rangel” de la Universidad de Los Andes en Trujillo, por presentar diferentes afecciones de la piel, se aislaron 3 especies diferentes dermatofitos: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis.

De las 52 cepas de bacterias esporuladas pertenecientes al género Bacillus, el 23 % (12 cepas) resultaron activas para inhibir el crecimiento en dos de las tres especies de dermatofitos aisladas de pacientes humanos que acudieron a la consulta: T. mentagrophytes  y T. rubrum. Contra M. canis mostraron actividad inhibitoria el 21% (11 cepas aisladas).

En la Tabla 1 se presentan los diámetros de inhibición los aislados de Bacillus spp. que resultaron  activos para inhibir el crecimiento de Trichophyton rubrum. Los aislados 11 y 12 de caprinos desarrollaron halos de inhibición de 36 y 20 mm. De gallina, los aislados GA₀₃, GA₀₇ y GA₁₈ desarrollaron halos de inhibición de 10, 22 y 20 mm respectivamente.  Los aislados 01 y 07 de porcinos desarrollaron halos de inhibición de 30 mm, mientras que los aislados 02 y 04 de porcinos desarrollaron halos de 35 y 40 mm respectivamente. Finalmente los aislados 01, 02 y 06 de vacunos desarrollaron halos de inhibición de 25, 10 y 36 mm respectivamente.

Tabla 1. Cepas de Bacillus spp. con actividad inhibitoria sobre el crecimiento de Trichophyton rubrum.

             CA: Caprinos; GA: Gallinas;   PO: Porcinos; VA: Vacunos

En la Tabla 2 se presentan los aislados de Bacillus spp. que resultaron activos para inhibir el crecimiento de T. mentagrophytes. El mayor halo de inhibición fue de 40 mm y lo desarrolló la cepa PO₀₄, seguido de un halo de 36 mm desarrollado por la cepa CA₁₁. Las cepas GA₁₈,  PO₀₂ y VA₀₆ desarrollaron halos de inhibición de 35 mm y las cepas PO₀₁ y VA06 25 mm. Las cepas CA₁₂, PO₀₇ y VA₀₁ desarrollaron halos de 20 mm, mientras que las cepas GA₀₇, GA₀₃ y VA₀₂ desarrollaron halos de inhibición de 18, 12 y 10 mm respectivamente.

Tabla 2. Cepas de Bacillus spp. con actividad inhibitoria sobre el crecimiento de Trichophyton mentagrophytes.

                 CA: Caprinos; GA: Gallinas;  PO: Porcinos; VA: Vaca

En la Tabla 3 se presentan las cepas de Bacillus spp. con actividad inhibitoria sobre el crecimiento de Microsporum canis. El mayor halo de inhibición fue de 38 mm y lo desarrollaron las cepas CA₁₁ y PO₀₄, seguido de la cepa VA₀₆ con 36 mm. Las cepas PO₀₂ y VA₀₁ desarrollaron halos de 26 mm de inhibición, mientras que la cepa GA₀₇ desarrolló un halo de inhibición de 20 mm. Las cepas PO₀₁ y VA₀₂ desarrollaron halos de 15 mm y las cepas PO₀₇ y GA₀₃ desarrollaron halos de inhibición de 12 mm. Finalmente las cepas CA₁₂ y GA₁₈ no fueron activas contra este dermatofito.

Tabla 3. Cepas de Bacillus spp. con actividad inhibitoria sobre el crecimiento de  Microsporum canis.

                 CA: Caprinos; GA: Gallinas;  PO: Porcinos; VA: Vacunos

En la Tabla 4 se presenta en conjunto la comparación de la actividad inhibitoria de las 12 cepas de Bacillus spp., aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos, contra las tres especies de dermatofitos aislados.

Tabla 4. Comparación de los halos de inhibición desarrollados por 12 cepas de Bacillus spp., contra tres especies de dermatofitos (T. rubrum, T. mentagrophytes y M. canis).

                  CA: Caprinos; GA: Gallinas;  PO: Porcinos; VA: Vaca

La cepa 04 aislada de porcino (PO₀₄) desarrolló el mayor halo de inhibición contra los tres dermatofitos. La cepa 11 aislada de caprino (CA₁₁) se comportó de forma muy similar frente a los tres dermatofitos, desarrollando halos de inhibición de 36 mm contra contra T. rubrum, T. mentagrophytes y 38 mm contra M. canis respectivamente. De igual forma se comportó la cepa 06 aislada de vacuno (VA₀₆). 

Cuando se observa el halo de inhibición desarrollado por el resto de las cepas contra las 3 especies de dermatofitos, se aprecia que, a excepción de las cepas GA₀₃ y VA₀₂, las cuales desarrollaron los menores halos de inhibición (12 y 10 mm), el resto se comportó de forma muy similar contra T. rubrum y T. mentagrophytes, mientras que contra M. canis exhibieron la menor actividad inhibitoria, siendo las cepas CA₁₂ y GA₁₈, inactivas contra este último dermatofito.

En el Gráfico 1 se representa el análisis de varianza con las medias de actividad antifúngica de las diferentes cepas Bacillus spp. y su respectiva desviación estándar.

Gráfico 1. Media y desviación estándar de las lecturas de halos de inhibición de los bacilos esporulados con las tres especies de dermatofitos.

GA: Gallinas (17,889 + 7,08); CA: Caprinos (28,667 + 8,16); VA: Vacuno (20,778+ 7,43); PO: Porcinos(28,833 + 9,48)

DISCUSIÓN

Antibióticos antifúngicos producidos por el género Bacillus han sido ensayados principalmente contra hongos fitopatógenos (6, 12, 13). Estos compuestos naturales han sido principalmente péptidos cíclicos integrados  por aminoácidos D y L y en algunos casos compuestos termoestables, como aislados  de Bacillus pumillus (6,14).

En el caso de las 52 cepas de Bacillus spp., aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos diferentes, se han detectado 12 cepas procedentes de bovino, caprino, porcino y gallinas con actividad fungistática contra tres dermatofitos, aislados de pacientes con lesiones micóticas en la ciudad de Trujillo.

Aunque no hemos identificado específicamente a estos bacilos esporulados, llama la atención que el 21 % de los mismos exhiban actividad fungistática, todo lo cual señala un alto potencial de actividad antimicótica en estas bacterias esporuladas presentes en el estiércol de animales domésticos. Destacamos que esta actividad antifúngica se produzca en un medio de cultivo relativamente sencillo y económico, lo cual sugiere el hallazgo de un área de investigación aplicada en este campo.

En estos resultados, las cepas productoras de antimicóticos, son agentes con un alto potencial de preservación natural que no demanda cuidados especiales. Se destacan estas características como factores adicionales para la realización de trabajos ulteriores, en donde el aislamiento y caracterización de productos crudos podrían ser utilizados en ensayos in vivo, como una etapa previa para estudios clínicos.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el desarrollo de este estudio permiten concluir lo siguiente:

1. Las muestras de estiércol de animales domésticos, provenientes del Estado Trujillo, contienen una amplia variedad de microorganismos esporulados pertenecientes al género Bacillus.

2. De las muestras de estiércol analizadas,  el mayor número de cepas de bacilos esporulados fue aislado de gallinas (19 cepas), seguido de caprinos (12 cepas) y de vacunos, porcinos y equinos se aisló el menor número de cepas (07).

3.La mayor actividad inhibitoria sobre el crecimiento in vitro de los dermatofitos, tomada como el mayor halo de inhibición, fue desarrollada por los cultivos de bacilos esporulados aislados de porcinos y caprinos, seguidos de vacunos y gallinas.

Este trabajo recibió financiamiento parcial de los proyectos ADG-CVI-NURR-03-95m y ZD-CPT-NURR-94

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