Evaluación de la termorresistencia en metabolitos antifúngicos producidos por esporulados del género Bacillus.

Castillo Colombo C*, Sosa Briceño M*, Scorza J**.

*   Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico del Núcleo Universitario “Rafael Rangel”. Laboratorio de Microbiología, Instituto Médico Valera.

** Centro de Investigaciones “José Witremundo Torrealba”. Núcleo Universitario “Rafael Rangel”, Universidad de Los Andes, Trujillo-Venezuela.

RESUMEN

12 cepas de Bacillus spp, activas para inhibir el crecimiento de hongos causales de dermatomicosis en humanos, fueron ensayadas para determinar la termorresistencia de los metabolitos antifúngicos. Las cepas fueron masificadas en infusión de corteza de papa a pH 7,4 y después de 96 horas de crecimiento en agitación, fueron autoclavadas a 120°C durante 15 minutos. Los cultivos fueron entonces ensayados contra dermatofitos (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis) sembrados en placas de petri con 10 ml de agar Sabouraud. Los cultivos autoclavados fueron colocados en penicilindros sobre el agar solidificado y revisados hasta verificar la actividad inhibitoria de los esporulados sobre  el crecimiento de los dermatofitos. En 7 cepas (58%) se verificó la termorresitencia de los metabolitos producidos por Bacillus spp. Resaltamos la importancia de estos hallazgos utilizando una metodología sencilla de aplicar en cualquier laboratorio y la utilización de medios de cultivos artesanales, que no requieren reactivos de difícil obtención, por lo que representa un área de investigación a ser explorada.

Palabras-clave: Termorresistencia, Bacillus, metabolitos, antifúngicos, actividad inhibitoria.

Thermal resistance evaluation in antifungal metabolites from sporulates of Bacillus genus.

ABSTRACT

Twelve (12) strains of Bacillus spp., active to inhibit the growth of fungal agents of dermatomycoses in humans, were assayed to determine the thermal resistance of antifungal metabolites. The strains were cultivates in potato infusion at pH 7,4 and, after 96 hours of growth in agitation, were sterilized at 120°C during 15 minutes. The cultures were assayed against dermatophytes (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum canis) placed in Petri dishes with 10 ml of Sabouraud agar. The sterilized cultures were placed in cilynders on the solidified agar and revised until verifying the inhibitory activity of sporulates against the growth of dermatophytes. In 7 strains (58%) were verified the thermal resistance of the metabolites taken place by Bacillus sp. We stand out the importance of these discoveries using a simple applying methodology in any laboratory, and the use of easy media of cultivations that do not require reagents of difficult obtaining, which represents an investigation area to be explored.

Key-words: Thermal resistance, Bacillus, metabolites, antifungal agents, inhibitory activity.

INTRODUCCIÓN

La mayoría de las especies de Bacillus tienen una amplia distribución en la naturaleza y se encuentran en suelo, agua y como parte de la flora intestinal normal de algunos mamíferos, incluyendo al hombre (1). Estos microorganismos se caracterizan por ser Gram-positivos y generalmente catalasa-positivos, exhibiendo diversas características fisiológicas. Una característica única del género es su capacidad para producir, durante el desarrollo, endosporas termorresitentes (2). 

Durante muchos años los esporulados pertenecientes al género Bacillus han sido ampliamente estudiados, entre otros aspectos, por su capacidad potencial para producir antibióticos.

Muchas sustancias fúngicas producidas por cepas del género Bacillus han sido caracterizadas como polipéptidos constituidos completamente por aminoácidos, aunque algunas puedan contener otros residuos; por ejemplo: el fungicida M4, producido por Bacillus licheniformis, que está compuesto por 34 residuos de aminoácidos de siete tipos (3).

Generalmente, los antibióticos producidos in vitro por cepas del género Bacillus son compuestos responsables del biocontrol in vivo, ya que algunas cepas productoras de antibióticos son capaces de suprimir enfermedades fúngicas en plantas (4).

Debido a problemas generados por el excesivo uso de pesticidas químicos en el área agrícola, que ha traído como consecuencia la acumulación de residuos tóxicos en el ambiente y en los alimentos, la tendencia actual es hacia la reducción del uso de tales fungicidas, para darle paso a los fungicidas de origen microbiano, como una estrategia alternativa para el manejo de plagas a nivel agrícola (5).

En Venezuela son pocos los reportes relacionados con la actividad antifúngica de metabolitos producidos por cepas de género Bacillus aislados de estiércol de animales domésticos. Igualmente, es escasa la información sobre la termorresistencia de esos metabolitos contra hongos causantes de dermatomicosis.

En nuestro país se han realizado experiencias con el uso de agentes microbianos esporuladores, como alternativa de control biológico. En 1954, Texera y Scorza (6) se plantearon la necesidad de evaluar bacterias esporuladoras como alternativas de control de moluscos hospedadores de Schistosoma mansoni. 

Es por ello que el presente trabajo fue realizado, para verificar la termorresistencia de metabolitos antifúngicos producidos in vitro por Bacillus spp. a las 96 horas de cultivo a temperatura ambiente, utilizando como medio de cultivo para su masificación, infusión de corteza de papas reforzada con glucosa y peptona. 

METODOLOGÍA

Doce (12) cepas del género Bacillus, aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos (gallinas, caprinos, porcinos, vacunos y equinos), a las cuales se les determinó previamente su actividad antifúngica contra dermatofitos (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis), fueron sembradas en infusión de corteza de papa, para determinar la termorresistencia del metabolito antifúngico. 

En una fiola de un litro, se colocaron 125 gr de corteza de papas con 500 ml de agua destilada en baño de María, agitando durante 30 minutos. Se filtró el sobrenadante a través de una capa de gasa y algodón, completándolo con agua destilada  hasta los 1.000 ml, y luego se añadieron 5 gr de glucosa y 5 gr de peptona. Se  esterilizaron en porciones separadas durante 30 minutos a 121ºC, para conservarlas en refrigeración hasta su uso, con un tiempo no mayor a 72 horas.

Las cepas antifúngicas de Bacillus fueron sembradas en infusión de corteza de papas a pH 7,4 durante 96 horas. Luego, los cultivos se esterilizaron en autoclave a 120ºC durante 15 minutos. Se prepararon suspensiones de dermatofitos (que eran mantenidos en cuñas de agar Sabouraud) y se sembraron en placas con 10 ml de agar Sabouraud. Una vez solidificado el agar, en cada placa se colocaron 4 penicilindros, que fueron llenados con el medio de cultivo conteniendo los cultivos de esporulados esterilizados previamente. Las placas fueron incubadas a 25ºC durante 2 semanas, siendo observadas diariamente hasta constatar el crecimiento uniforme de los dermatofitos y sus halos de inhibición (Figura 1). 

Figura 1. Evaluación de la termoestabilidad de los metabolitos antifúngicos de los esporulados

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 

De las 12 cepas de bacterias esporuladoras pertenecientes al género Bacillus aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos provenientes de diferentes localidades del estado Trujillo, que resultaron activas para inhibir el crecimiento de dermatofitos aislados en nuestro laboratorio (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis), el 58% (07 cepas) produjeron durante su desarrollo metabolitos antifúngicos termorresistentes.

En las Tablas 1 y 2 se presentan los resultados del número y origen de las cepas que desarrollaron metabolitos antifúngicos termorresistentes, así como del halo de inhibición frente a los diferentes dermatofitos. 

Tabla 1. Cepas de Bacillus termorresistentes con actividad inhibitoria contra Trichophyton rubrum.

                 CA: Caprinos; GA:  Gallinas; PO: Porcinos

Tabla 2. Cepas de Bacillus termorresistentes con actividad inhibitoria contra Trichophyton mentagrophytes

                    CA: Caprinos; GA: Gallinas; PO: Porcinos

Las 7 cepas que produjeron metabolitos antifúngicos termorresitentes   mostraron actividad inhibitoria contra el crecimiento de  T. mentagrophytes y T. rubrum, mientras que sólo una cepa proveniente de estiércol de porcino (PO01) mostró actividad inhibitoria contra  Microsporum canis.

La literatura disponible sobre los ensayos de sustancias antifúngicas producidas por los microorganismos pertenecientes al género Bacillus, nos permite deducir que la mayoría de los ensayos han sido realizados principalmente contra hongos fitopatógenos (3, 5, 7) 

En estudios realizados sobre la producción de antibióticos en bacterias aisladas de sus hábitats naturales pertenecientes al género Bacillus (3), se demostró la capacidad potencial de estos microorganismos para inhibir el crecimiento de hongos patógenos humanos, tales como Sporothrix schenckii y Microsporum canis.

En los resultados obtenidos en este ensayo, de las 12 cepas de Bacillus sp., aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos diferentes, se detectaron 07 cepas con actividad fungistática, termorresistente contra tres especies de dermatofitos aislados de pacientes con lesiones micóticas en la ciudad de Trujillo.

CONCLUSIONES

1.   Es posible el aislamiento de Bacillus sp. a partir de muestras de estiércol de animales domésticos, provenientes del estado Trujillo.

2. La infusión de corteza de papas reforzada con glucosa al 10% representa un excelente medio para la masificación de cepas del género Bacillus.

3. Algunas cepas de Bacillus sp. aisladas de muestras de estiércol de animales domésticos producen, durante su crecimiento en medios líquidos y sólidos, metabolitos termoestables con actividad inhibitoria sobre el crecimiento de hongos causantes de dermatomicosis aislados de humanos.

Este trabajo recibió financiamiento parcial de los proyectos ADG-CVI-NURR-03-95m y ZD-CPT-NURR-94.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Washintong C. 2000. Diagnóstico Microbiológico. Quinta Edición. Editorial Médica Panamericana.        [ Links ]

2.  Kenneth Todar. University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology © 2003. (http://textbookofbacteriology.net/Bacillus.html).        [ Links ]

3.  Lebbadi M, Gálvez A, Maqueda M, Martinez-Bueno M, Valdivia E. Fungicin M4: a narrow spectrum peptide antibiotic from Bacillus licheniformis M4. J Appl Bacteriol 1994; 77: 97-108.        [ Links ]

4.  Ferreira J, Matthee F, Thomas A. Biological control of Eutypata lata on grapevine by an antagonic strain of Bacillus subtilis. Phytopatol 1991; 81: 283-7.        [ Links ]

5.  Munimbazi C, Bullerman L. Isolation and partial characterization of antifungal metabolites of Bacillus pumilus. J Appl Microbiol 1998; 84: 959-68.        [ Links ]

6. Texera D, Scorza J. Investigaciones sobre una forma bacteriana parecida al Bacillus pinotii hallada en Venezuela con acción patógena sobre el Australorbis glabratus.  Say Archiv Venezol Patol Trop & Parasitic Med 1954; 2(2): 235-42.         [ Links ]

7.  Leifert C, Li H, Chidburee S, Hampson S, Workman S, Sigee D, et al. Antibiotibiotic production and biocontrol activity by Bacillus subtilis CL27 and  Bacillus pumilus CL45. J Appl Bact 1995; 78: 97-108.        [ Links ]