Estandarización del inóculo de Cladophialophora carrionii por el método espectrofotométrico para estudios de sensibilidad in vitro de hongos filamentosos.

Rojas García OC*, Vivas Alcalá JJ**, Guerrero Onofretti AJ*.

* Unidad de Investigación Microbiología-Inmunología, Centro de Investigaciones Biomédicas, Decanato de Medicina, Universidad Centrooccidental “Lisandro Alvarado”, Barquisimeto, Venezuela.

** Laboratorio de Fisicoquímica de Parásitos, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

RESUMEN

El crecimiento reciente de infecciones por hongos dematiáceos y el indiscriminado uso de drogas antifúngicas, motivaron la preparación y estandarización de un inoculo que cumpla con las normas NCCLS, siguiendo el protocolo M-38P, que garantice un método reproducible, eficaz y sencillo para las pruebas de sensibilidad in vitro. Se obtuvieron 9 aislados de Cladophialophora carrionii de pacientes con cromomicosis procedentes del municipio Urdaneta, área endémica del estado Lara, Venezuela. Se trabajó con filtrado de conidias, a partir de un micelio en fase de conidiogénesis, obteniéndose una suspensión de conidias, estandarizadas a 5,5 x 10⁵-1,2 x 10⁶ UFC/ml, cuantificadas en cámara de Neubauer. El inóculo fue constatado, realizando siembras en agar glucosado de Sabouraud en cultivo en placas. Con este método se observó un estrecho margen de variabilidad en los aislados estudiados. Es de fácil ejecución, mostrando ser útil en las pruebas de sensibilidad in vitro a antifúngicos en hongos dematiáceos. 

Palabras-clave: Estandarización, inóculo, Cladophialophora carrionii, sensibilidad in vitro.

Cladophialophora carrionii inoculum standardization by the spectrophotometric method for the in vitro susceptibility studies of filamentous fungi.

ABSTRACT

The recent growth of infections caused by dematiaceous fungi and the indiscriminate use of antifungal drugs, motivated the preparation and standardization of an inoculum that fulfills the NCCLS norms, following M-38P protocol, and guarantees a reproducible, effective, and simple method for the in vitro susceptibility tests. 9 strains of Cladophialophora carrionii were isolated of chromoblastomycoses patients, coming from the Urdaneta municipality, endemic area of Lara state, Venezuela. It worked with conidia filtrate, starting from conidiogenesis phase mycelia, being obtained a conidial suspension, standardized to 5,5 x 10⁵-1,2 x 10⁶ UFC/ml, quantified in Neubauer chamber. The inoculum was verified, carrying out cultures in Sabouraud dextrose agar in petri dishes. With this method, a narrow margin of variability was observed in the studied isolates. It is of easy execution, showing to be useful for the in vitro susceptibility tests to antifungal drugs in dematiaceous fungi.

Key-words: standardization, inoculum, Cladophialophora carrionii, in vitro susceptibility tests.

INTRODUCCIÓN

La cromomicosis es una infección granulomatosa crónica de la piel y tejido celular subcutáneo, causada por varios hongos dimorfos, cuyo hábitat es el suelo, vegetales y materia orgánica en descomposición, clasificados en la  familia Dematiaceae de los Hyphomycetes (1, 2). Es una enfermedad cosmopolita, reportada en los cinco continentes, con mayor frecuencia en los países tropicales y subtropicales. Hasta el momento se aceptan cinco agentes etiológicos: Cladophialophora carrionii, Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea compacta, Rhinocladiella aquaspersa y Phialophora verrucosa.  Los más comúnmente aislados son: F. pedrosoi, de zonas tropicales húmedas, y C. carrionii, de zonas xerófilas (3). En Venezuela, el área endémica comprende la región noroccidental. C. carrionii es la especie más comúnmente aislada; se encuentra en áreas de climas semiáridos, con temperaturas mayores de 24°C), mientras que F. pedrosoi se ubica en áreas húmedas, con temperaturas menores a 24°C (2).

En el tratamiento de la cromomicosis han sido ensayados varios procedimientos, como la extirpación quirúrgica, termoterapia, electrocoagulación o la crioterapia, causando cicatrices indeseables (4-6). Posteriormente se implementó el abordaje racional y, conociéndose los blancos bioquímicos específicos, se usaron fármacos tales como el 5-fluouracilo en tratamientos tópicos y sistémicos como 5-fluorocitosina, el cual actúa como inhibidor de la síntesis de ADN y ARN (7, 8). La anfotericina B, un antibiótico poliénico, también utilizado durante los años 50 en el tratamiento de la cromomicosis; interactúa directamente con esteroles (ergosterol) de la membrana plasmática fúngica (9,10). También se ha utilizado ketoconazol, el primero de esta generación, empleado en la década de los 80, itraconazol y saperconazol, compuestos azólicos inhibidores de la síntesis endógena de esteroles (11-13)

En la actualidad se han producido nuevos antifúngicos tales como: Syn 2836, Syn 2869, Syn 2903 y Syn 2921 (compuestos análogos a azoles); CS-758 (R-120758) (compuesto análogo a triazoles); derivados de azasordarina  (su mecanismo de acción está basado en inhibir las síntesis de proteínas); SS750 (el cual presenta afinidad por el citocromo P₄₅₀ y origina el complejo CO-P₄₅₀); las equinocandinas (caspofungina, anidulafungina, etc.);  UR-982; ravuconazol; las nuevas formulaciones liposómicas o asociadas a lípidos antifúngicos clásicos, como anfotericina B y nistatina, entre otros; y posaconazol (SCH 56592) (10, 14-16). En Venezuela se están sintetizando drogas experimentales, que tienen como blanco al ergosterol; son los análogos de azasteroles, las hidrazonas y otros, que actúan en la ruta de síntesis de los fosfolípidos y el ajoene, utilizado en estudios in vivo e in vitro, indicando que las principales vías metabólicas de la fosfatidilcolina son bloqueadas de manera selectiva (18-22).

Las nuevas propuestas de antifúngicos suponen una mejora de la eficacia clínica y, paralelamente, una reducción de la toxicidad. En cierto modo, una mayor disponibilidad de antifúngicos hace necesario caracterizar su potencia; es decir, disponer de una base estadística de valores de actividad in vitro frente a distintos patógenos. Con ello se procede a establecer la posible eficacia clínica, a fin de orientar al clínico en una decisión terapéutica. Igualmente, es útil conocer las posibles tasas de resistencia (primaria y secundaria, o bien intrínseca o adquirida) observadas in vitro, originadas por distintas causas, como de forma particular los valores concretos de los aislamientos.

Hacia finales de los años 50, las pruebas de sensibilidad de microorganismos eran confusas, ya que no existían procedimientos estandarizados aceptables. Esto condujo a la formación de un grupo de cooperación internacional, que se ocupó de establecer un estándar recogido en un informe conocido como “informe ICS” (Intermational Collaborative Study). Este fue el inicio de la estandarización de las pruebas a antimicrobianos. Esta serie de acontecimientos desencadenaron la aparición y aceptación de un método de referencia conocido como “Método de dilución en caldo” (23).

El crecimiento reciente de infecciones por hongos patógenos y oportunistas, a raíz de la pandemia del SIDA y el indiscriminado uso de drogas antifúngicas, motivaron la aparición de normas de estandarización. Con el fin de comparar resultados de diferentes laboratorios surgen las normas del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), con los protocolos M27-A para levaduras y M-38P para filamentosos (33, 34), y las normas del European Comittee of Antibiotic Susceptibility Testing Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (EUCAST), todo ello con el objetivo de garantizar métodos reproducibles, eficaces y sencillos para las pruebas de sensibilidad in vitro en hongos. En el caso de los dematiáceos, hongos filamentosos endémicos en ciertas regiones de Venezuela, con el propósito de adaptar estos protocolos se aborda el problema de la preparación y estandarización del inóculo como parte de este trabajo de normalización.

Los resultados obtenidos tras analizar la sensibilidad de los microorganismos deben servir para elegir de forma óptima el tratamiento empírico en la comunidad y en el hospital (23).

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislados: Se obtuvieron y caracterizaron morfológicamente 9 (nueve) aislados de Cladophialophora carrionii  procedentes de pacientes con cromomicosis del municipio Urdaneta del estado Lara, área endémica para esta patología.

La identificación del agente etiológico se realizó en el Laboratorio de Micología de la Sección de Microbiología del Decanato de Medicina de la Universidad Centrooccidental Lisandro Alvarado de Barquisimeto, estado Lara,  a través de la técnica de microcultivo,  para la observación de la morfología microscópica del hongo (50). Los cultivos aislados e identificados se mantuvieron  en agar de Sabouraud a 24°C de temperatura.

Medios de cultivo: Medio de Sabouraud dextrosa agar (glucosa 2%, peptona 1%, agar 1,5% en agua destilada). RPMI 1640 adicionado de 2% de glucosa.

Método espectrofotométrico: Se acogieron las recomendaciones para trabajar con hongos filamentosos de la NCCLS en el documento M38-P(34), con la incorporación de modificaciones generadas como parte del desarrollo de este trabajo. Se utilizó la técnica de espectrofotometría, con placas de ELISA estériles, de  96 pozos de fondo plano. Para realizar las lecturas se empleó un lector marca Sunrise Tecan Magellan CF data exchange only RS 232, a una longitud de onda de 492 nm (35). 

Preparación del inóculo: El inóculo se preparó a partir de conidias obtenidas de los aislados de C. carrionii, mantenidas a temperatura ambiente (24°C) en agar glucosado de Sabouraud, mediante siembras sucesivas. Para la obtención de suficientes conidias se adicionaron 5 ml de medio RPMI 1640 + 2% de glucosa en 3 tubos conteniendo la colonia del hongo filamentoso bien crecido en fase de esporulación. Luego se raspó la superficie de la colonia con la punta de una pipeta Pasteur estéril (36-40). De esta forma se obtuvo una suspensión turbia, formada de conidias, trozos de hifas y micelio; se llevó a vórtex durante cinco minutos, para separar la mayor cantidad de conidias del micelio, filtrándose a través de un embudo cubierto con lana de vidrio, para separar las conidias (en el filtrado) del micelio retenido en la lana de vidrio. Se obtuvo más de un 90% de conidias puras.

Curva de calibración: Para hacer la curva de calibración densidad óptica (D.O.) vs número de conidias/ml, se partió de un cultivo de hongos bien crecido (seis semanas) sobre agar Sabouraud. Se procedió a la separación de las conidias, como ya fue descrito, y se determinaron de manera directa el número de conidias/ml, en cámara de Neubauer. Luego se procedió a realizar diluciones seriadas en RPMI 1640 + 2% de glucosa, midiéndose la D.O. de cada dilución a 492 nm hasta alcanzar una D.O. de 0,025, la cual correspondió a 550.000 conidias/ml, procediéndose a graficar los valores de absorbancia vs número de conidias/ml, en el programa de Sigma Plot 6.1. Con esta curva de calibración se estimaba en cada oportunidad la población de las conidias obtenidas, para ajustar en cada ensayo el inóculo de partida homogéneo en todos los casos.

Curvas de crecimiento: El crecimiento de C. carrionii en forma de micelio a partir del inóculo de conidias se hizo en pozos de fondo plano en placas de microdilución, a partir de cierta cantidad de conidias. El crecimiento en forma de micelio se siguió temporalmente por cambios turbidimétricos, en un lector de ELISA, a una longitud de onda de 492 nm, realizándose lecturas por 8 días. Las primeras 72 horas las lecturas se realizaron cada 12 horas, posteriormente cada 24 horas, hasta el 8vo. día. Se inocularon por triplicado 200 µl de una suspensión de conidias con una densidad óptica de 0,025 a 0,055, correspondiente a 5,5 x 10⁵ a 1,2 x 10⁶ conidias/ml, respectivamente. El cambio de densidad óptica (D.O.) refleja el incremento en masa de micelio, producto del crecimiento del hongo. Las placas se mantuvieron incubadas en una caja en atmósfera húmeda con papel filtro humedecido con agua, para evitar la desecación del medio de cultivo, y a la temperatura del laboratorio de 24°C. Se graficaron los datos D.O. vs tiempo en el programa Sigma Plot, versión 6.1.

Para la determinación del tiempo de generación, que es el tiempo que tarda una célula en dividirse cuando el cultivo se encuentra en la fase exponencial, se  tomaron los datos de la región de la curva de crecimiento, donde se observo la fase exponencial (antes del cambio de pendiente en la sigmoide). Se grafica el logaritmo de la D.O. vs. tiempo; se obtiene así una recta con la siguiente ecuación:

2,3 log (D.O.)= 2,3log (D.O.)0 + m (t)

donde: (t)=tiempo en horas, (D.O.)= densidad óptica a un tiempo (t); (D.O.)0= Densidad óptica del cultivo inicial y m= pendiente.

En la fase exponencial de la curva de crecimiento, el tiempo Tg es el tiempo generacional, en el cual se duplica la población a un ritmo constante durante la fase exponencial. Durante esta etapa, cuando D.O.= 2 D.O.0 , entonces t= Tg, y la ecuación se transforma en:

2,3log 2 (D.O.) - 2,3log (D.O.)0= m(Tg)

Despejando el tiempo de generación se tiene:

Tg= (2,3x log2) / m

El Tg también se mide directamente sobre la gráfica, tomando el intervalo de tiempo necesario para duplicar la población.

Viabilidad de las conidias en el inóculo: Partiendo de una suspensión celular de 0,025 de densidad óptica, correspondiente a 550.000 conidias/ml, se realizaron las diluciones seriadas hasta 1:1000. Tomamos 1 ml del inóculo diluido y se mezcló con 9 ml de solución salina al 0,85% de NaCl dilución 1:10, agitándose luego en vórtex por 5 minutos. De esta suspensión se tomaron 15 µl, los cuales se sembraron  en una placa de Sabouraud glucosa agar, dispersando el inóculo por toda la placa, por agotamiento, siendo ésta incubada a 24°C por varios días, observándose diariamente hasta la aparición de las colonias, correspondiendo cada conidia a una unidad formadora de colonia (UFC).

RESULTADOS

Se identificaron 9 aislados de pacientes con cromomicosis, procedentes del área endémica en el estado Lara.

La preparación del inóculo se hizo a partir de filtrado del hongo para la obtención de conidias. Se utilizó el método espectrofotométrico en placas de microdilución, a una longitud de onda de 492 nm, y las densidades óp ticas variaron entre 0,025 y 0,055 respectivamente, correspondiendo a 5,5x10⁵ a 1,2x10⁶ UFC/ml  para las nueve especies de C. carrionii estudiadas.

La curva de calibración de los aislados de C. carrionii se obtuvo al graficar densidad óptica contra el número de conidias por mililitro (ver Gráfico 1).

Gráfico 1. Curva de calibración conidias D.O. vs Nº de conidias x 106/ml  

La viabilidad de las conidias en todos los casos fue del 100%

La curva de crecimiento sobre los diferentes aislados se corresponde a una población que duplica su masa en fase exponencial, en forma binaria, con fase exponencial de 50 horas. Luego se obtiene un crecimiento desacelerado hasta alcanzar la fase estacionaria a las 40 horas.

En el Gráfico 2 se observa el crecimiento del aislado 019. Con los datos de la fase exponencial, se procedió a calcular el Tg de todos los aislados (Tabla 1).

Gráfico 2. Curva de crecimiento aislado 019 Cladophialophora carrionii en medio RPMI 1640 + 2% de glucosa a 24ºC.

Tabla 1. Tiempo de generación en horas para cada uno de los aislados de Cladophialophora carrionii.

DISCUSIÓN

Se obtuvieron  nueve aislados de C. carrionii, procedentes de pacientes diagnosticados en el Hospital “Dr. Luis Ignacio Montero” de Siquisique, municipio Urdaneta del estado Lara. Este municipio tiene un clima semidesértico, con una vegetación de tipo bosque espinar y altas temperaturas que llegan hasta 35°C, el ambiente adecuado para la existencia de este hongo dermatiáceo, como lo describiera Borelli en 1972.

En los estudios de sensibilidad a los antifúngicos de este tipo de hongos, es importante la estandarización de las pruebas de sensibilidad correspondientes, proceso que se inicio años atrás. En 1981, la Sociedad Francesa de Micología Médica publica un artículo de recomendaciones, para estandarizar la sensibilidad in vitro a los antifúngicos. En 1982, la NCCLS crea el subcomité para la estandarización de pruebas de sensibilidad a los antifúngicos, y no fue sino hasta finales de 1992 cuando se publica el documento M27-P, el cual hace referencia al método de macrodilución para levaduras. 

Sin embargo, la falta de un adecuado grado de estandarización de las técnicas de estudio de sensibilidad in vitro, a fin de llegar a una mejor correlación in vitro e in vivo, propició la aparición del documento M38-P para el estudio de la sensibilidad de hongos filamentosos. Los primeros estudios de monitoreo se hicieron en hongos filamentosos hialinos por espectofotometría en placas, de 96 pozos de fondo plano, con micelio fragmentado (Thimothy C. Granade y col, 1985). Su trabajo fue pionero en esta área, sin ningún patrón estándar para realizar estudios con hongos filamentosos.

En 1997, Guarro y col., reportan la preparación de un inóculo a partir de una suspensión de conidias germinadas, obtenidas de un crecimiento del hongo en agar. Los autores utilizaron este inóculo de hifas pequeñas (conidias germinadas), con hongos filamentosos de importancia clínica, Cladophialophora sp., Paecelomyces sp., entre otros. Nuestra  metodología fue similar: obtuvimos una suspensión de conidias a partir de un micelio bien crecido en fase de conidiogénesis. Las conidias se desprendieron del micelio hacia una suspensión acuosa mecánicamente (raspado y vórtex); posteriormente se filtró en lana de vidrio y se obtuvo una preparación con más de 90% de conidias, la cual se utilizó en los estudios posteriores.

Otros autores han trabajado en el problema del inóculo para formas miceliales. Galgiani, en 1992, organizó un simposio sobre la estandarización de las pruebas de sensibilidad a antifúngicos, y presenta los inconvenientes de trabajar con hongos filamentosos, poniendo especial atención en la morfología de la conidia y su crecimiento a través de propágulas, lo que se observa en los estudios in vitro. Correlacionaron su trabajo con estudios in vivo, utilizando como ejemplo Aspergillus. Para obtener los inóculos rasparon la superficie de los cultivos y contaron luego en un hematocitómetro las conidias/ml, con lo cual ensayaron estudios para la microdilución en caldo y compararon inóculos de hifas y conidias.

Pujol y col., en 1997, evaluaron el método por espectofotometría, utilizando como medio de cultivo el RPMI 1640, con hongos filamentosos. Tomaron en cuenta el tamaño del inóculo, (filtrado con gasa estéril y contando con cámara de Neubauer), obteniendo el inóculo similar al procedimiento realizado en este trabajo, obteniendo 10⁶, 10⁵ y 10⁴ conidias/ml. Cermeño y col., 1998, reporta la utilidad de la preparación del inóculo de hongos dematiáceos, homogeneizando el inóculo.

CONCLUSIONES

Se ensayaron diferentes concentraciones de inóculos, para poder estandarizar la metodología. Se utilizó el método espectrofotométrico, en placas de 96 pozos de fondo plano, leyendo a una longitud de onda de 492 nm, lo que permitió trabajar con un rango de mínima variabilidad, comprendido entre 0,025 y 0,055, respectivamente, correspondiendo a 5,5x10⁵ a 1,2x10⁶ UFC/ml  para las nueve especies de C. carrionii estudiadas. Este método espectrofotométrico en microplacas, es una técnica reproducible para seguir el crecimiento de hongos filamentosos y los efectos antiproliferativos sobre ellos.

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