Métodos fenotípicos para la detección de betalactamasas de espectro extendido en cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.

Camacho-Molina L¹, Perozo-Mena A², Castellano-González M³, Bermúdez-Navarro E¹, Harris-Socorro B⁴.

¹ Magister Scienciarum en Microbiología, Escuela de Bioanálisis, Laboratorio de Bacteriología, La Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

² Magister Scienciarum en Microbiología, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Práctica Profesional de Bacteriología, La Universidad del Zulia, Centro de Referencia Bacteriológica, Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo, Maracaibo, Venezuela.

³ Magíster Scientiarum en Microbiología, Escuela de Bioanálisis, Cátedra de Bacteriología General, La Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

RESUMEN

La producción de BLEE por cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae es un grave problema de salud pública, ya que causa la pérdida de la eficacia terapéutica a los antibióticos ß-lactámicos. En este trabajo se utilizaron cinco métodos para la detección fenotípica de BLEE. Se estudiaron 130 cepas de E. coli y 67 de K. pneumoniae, aisladas de los cultivos bacteriológicos realizados en el CRB-SAHUM. Los métodos de descarte y confirmatorios del NCCLS mostraron ser muy efectivos en la detección de cepas BLEE positivas, especialmente los métodos basados en la CIM. Adicionalmente se utilizó el método del doble disco. Éste demostró ser tan sensible y específico como los métodos estandarizados del NCCLS, ya que los resultados no demostraron diferencias significativas. Todos los métodos empleados tuvieron un desempeño parecido; se recomienda ampliamente el empleo del método de doble disco, por ser de bajo costo y de fácil aplicación en la rutina diaria de un laboratorio de Bacteriología.

Palabras-clave: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, betalactamasas de espectro extendido (BLEE).

Phenotypic methods for detection of extended spectrum betalactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains.

ABSTRACT

Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae ESBL producer strains are a serious public health problem since cause therapeutic effectiveness loss to the betalactam antibiotics. In this study five methods were used to detect phenotypic ESBL production. 130 E. coli and 67 K. pneumoniae, isolated from bacteriological cultures carried out in the CRB-SAHUM, were studied. The screening and confirmatory NCCLS methods showed to be very good in the detection of ESBL positive strains, especially the methods based on the MIC. Additionally it was used the double disk method, this it demonstrated to be so sensitive and specific as the standardized methods of the NCCLS, since the results did not demonstrate significant differences. All the used methods had a similar performance; it is highly recommended the use of the double disk method, to be of low cost and easy of application in the daily routine of a bacteriology laboratory.

Key-words: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, extended spectrum betalactamases.

INTRODUCCIÓN

Uno de los grupos de antibióticos más importante, tanto histórica como clínicamente, es el grupo de los ß-lactámicos. Éstos incluyen las penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbapenemos y monobactámicos, entre otros antibióticos médicamente útiles (1, 2), los cuales son los más utilizados para el tratamiento de las infecciones bacterianas, debido a su baja toxicidad y a su amplio espectro (3).

Los antibióticos ß-lactámicos constituyen una amplia familia, cuyo nombre deriva del hecho de poseer un anillo ß-lactámico como sitio activo, que actúa como análogo de la acil-D-alanina y se enlaza fuertemente a las enzimas que catalizan la transpeptidación de las unidades ácido N-acetil murámico (MurNac) dentro de la pared celular, siendo dicha transpeptidación importante porque la formación de enlaces cruzados estabiliza la pared celular y le imparte la fuerza tensil necesaria para resistir la lisis osmótica. Los antibióticos ß-lactámicos impiden la síntesis de la pared celular bacteriana, al inhibir la síntesis del peptidoglicano a través de la inactivación de una o varias proteínas (transpeptidasas) de unión a penicilina (PBP) (4, 5). 

La resistencia bioquímica a los antibióticos ß-lactámicos se puede atribuir a cuatro mecanismos diferentes: inactivación enzimática de la droga; alteración del sitio blanco; incapacidad de la droga de alcanzar su sitio blanco, debido a modificación de las porinas a nivel de la pared celular y eflujo de la droga una vez que ingresa. La base más importante para la resistencia de las bacterias a la penicilina, ya sea que esto ocurra de manera natural o adquirida, es la inactivación de las drogas por las enzimas ß-lactamasas, que abren el anillo de las penicilinas y demás ß-lactámicos entre los átomos de C y N para formar compuestos inactivos (6, 7).

La diseminación de las ß-lactamasas TEM-1, TEM-2 y SHV-1 son consecuencia de la presión selectiva ejercida por la introducción de la ampicilina, carbenicilina y las primeras cefalosporinas en los años 60. TEM-1 fue detectada en un aislamiento de E. coli resistente a ampicilina en 1965, pero pronto fue diseminada a todas las enterobacterias. En 1969 se detectaron enzimas TEM en Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y de 1973 a 1975 se encontraron en Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae y Neisseria gonorrhoeae (8, 9). En 1983 se detectaron en Alemania los primeros aislamientos clínicos de Klebsiella pneumoniae y E. coli, resistentes a cefalosporinas de tercera generación. Posteriormente a su análisis, se demostró que la resistencia era debida a la producción de una ß-lactamasa plasmídica transferible; estas enzimas se denominaron ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE), ya que eran capaces de hidrolizar un buen número de antibióticos ß-lactámicos, incluyendo los que contienen el grupo oximino, como las cefalosporinas de tercera y cuarta generación, así como al aztreonam (10, 11, 12). Estas enzimas derivan por mutaciones concretas en los genes que codifican las ß-lactamasas clásicas (TEM-1, TEM-2 y SHV-1), originando cambios en su secuencia de aminoácidos. Estas mutaciones han dado lugar a una gran variedad de enzimas (de TEM-3 a TEM-29 y de SHV-2 a SHV-7) (13-16).

La aparición de bacterias productoras de BLEE tiene importantes repercusiones clínicas y terapéuticas: a) la mayoría de los aislamientos tienen codificada la resistencia en plásmidos que pueden ser transmitidos a otros microorganismos; b) son causantes de brotes por infección; c) aumentan la morbimortalidad nosocomial; y d) limitan las opciones terapéuticas, incrementándose el uso de antibióticos costosos como el imipenem (17, 18).

Los microorganismos que más comúnmente sintetizan BLEE son Klebsiella sp. y E. coli, pero también se han detectado en Salmonella sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Morganella morganni, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia y Capnocytophaga ochracea (19). Se ha descrito que la administración indiscriminada de cefalosporinas de espectro extendido, particularmente ceftazidima, es una de las principales causas de la aparición de estas cepas. Cepas productoras de BLEE han ocasionado brotes de infección intrahospitalaria con multirresistencia a los antibióticos, dificultando el tratamiento y aumentando la morbimortalidad nosocomial. Los brotes fueron controlados al reducir la utilización de ceftazidima junto con la implementación de medidas de control de infecciones (20-22). 

La gran cantidad de pruebas y los altos costos que representa la detección de las cepas productoras de BLEE limitan su aplicación en algunos laboratorios de Microbiología, especialmente en los de rutina, lo que trae como consecuencia la instalación de terapias que resultan ineficaces y que además inducen la diseminación de la resistencia. No existen datos suficientes que correlacionen tipos de BLEE con terapias antimicrobianas, tipos de infección, severidad de la enfermedad de base, dosis y duración de la terapia, lo que hace difícil evaluar las opciones terapéuticas (3, 23). Se requieren estudios en la región zuliana para conocer las características epidemiológicas de las cepas productoras de BLEE, sobre todo por la resistencia a cefalosporinas. La detección oportuna de estas cepas en los hospitales, permite la implementación de medidas de control de infecciones, para impedir su diseminación y, lo más importante, brindar una terapia apropiada a quienes sufren una infección por una bacteria productora de BLEE.

La confirmación fenotípica de estas cepas justifica su investigación, ya que si alguna es productora de BLEE, la recomendación del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (24) es reportar resistencia a todos los antibióticos ß-lactámicos, ya que diferentes estudios han demostrado falla terapéutica si se utilizan. La gran diversidad de BLEE obliga a los laboratorios a estar preparados para detectar los diferentes tipos de resistencia, lo que permitiría que se adopten rápidamente las medidas de control. La detección oportuna por parte del laboratorio clínico de una cepa productora de BLEE permitiría activar los mecanismos de control tendentes a evitar su diseminación en el ambiente hospitalario, lo que disminuiría la estadía de los pacientes dentro del mismo, facilitaría su tratamiento y disminuiría los costos de hospitalización, repercutiendo en la calidad de vida del paciente y su comunidad (2, 25, 26).

Este estudio se condujo para detectar la producción de BLEE por diferentes métodos en cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae aisladas de pacientes del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM). El objetivo de este trabajo es determinar cuál de los métodos fenotípicos disponibles es capaz de detectar el mayor número de cepas productoras de BLEE, para de esta manera estandarizarlo y tratar de implementarlo en los laboratorios de Bacteriología de rutina de las instituciones prestadoras de salud.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se llevó a cabo un estudio descriptivo, prospectivo, y un muestreo no probabilístico de casos consecutivos. Se analizó la producción de BLEE en un total de 197 cepas, 130 de E. coli y 67 de K. pneumoniae, aisladas de cultivos bacteriológicos procesados en el Centro de Referencia Bacteriológica (CRB) del SAHUM, durante el período de octubre a diciembre de 2003. El aislamiento, identificación y conservación de estas cepas fue realizado por el personal del referido centro, mientras que las pruebas de detección de BLEE se realizaron en el laboratorio de Bacteriología de la Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia (LUZ). Para el análisis estadístico se utilizaron los paquetes estadísticos Statistix versión 1.0 y SPSS versión 11.0. Como estadístico de prueba se utilizó el Chi-cuadrado (X2), con un nivel de significancia del 95%.

Las muestras se cultivaron en medios de cultivo estándar, y el aislamiento e identificación bacteriana se realizaron siguiendo la metodología convencional descrita por Murray y col., 2003 (27). Las cepas a estudiar fueron repicadas en agar nutritivo (AN) (Difco) y agar cepa (AC). Las cepas así preservadas fueron trasladadas hasta el laboratorio de Bacteriología de la Escuela de Bioanálisis de LUZ.

Una vez realizada la identificación y verificada la pureza en agar MacConkey (MC) (Himedia) de las cepas de E. coli y K. pneumoniae, se procedió a realizar la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana según el método de difusión del disco en agar mediante la técnica de Baüer y Kirby (28), siguiendo estrictamente las normas del NCCLS (24). Paralelamente, se probaron cepas control de E. coli ATCC 25922 BLEE (–) y K. pneumoniae ATCC 700603 BLEE (+).

Para realizar la selección inicial de las cepas se utilizó el método de descarte por difusión del disco en agar, y la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) por dilución en agar, ambos métodos recomendados por el NCCLS (24). Para el Método de difusión del disco en agar se utilizaron discos comerciales de papel, impregnados con los siguientes antimicrobianos: aztreonam (ATM), 30µg; cefotaxima (CTX), 30µg; ceftazidima (CAZ), 30µg; cefpodoxima (CPO), 10µg; y ceftriaxona (CRO), 30µg. Como criterios para la clasificación de las cepas como posibles productoras de BLEE se utilizaron los siguientes puntos de corte: ATM <27mm; CTX <27mm; CAZ <22mm; CPO <17mm y CRO <25 mm. Por otra parte, para el método de CIM por dilución en agar se realizaron diluciones seriadas dobles desde 256 µg/ml hasta 0,125 µg/ml de los antimicrobianos CRO, CTX y CAZ, respectivamente. A todas las cepas de E. coli y K. pneumoniae se les determinó la CIM preparando una suspensión bacteriana con una concentración de 104 UFC/ml. Conjuntamente se probaron las cepas controles de E. coli ATCC 25922 BLEE (–) y K. pneumoniae ATCC 700603 BLEE (+). La CIM se interpretó de acuerdo a los criterios del NCCLS 2004 (24). Cuando el rango de la concentración del antimicrobiano es = 2 µg/mL se sospecha de ser productoras de BLEE.

Una vez identificadas las cepas como posibles productoras de BLEE, el NCCLS recomienda realizar pruebas confirmatorias que permitan corroboran la producción de BLEE por parte de la cepa estudiada. Para ello se utilizan dos métodos: el método del disco combinado y el método de E-test. El método del disco combinado se emplea para confirmar los resultados obtenidos por el método de difusión del disco en agar; para ello se utilizan discos de papel filtro impregnados con las diferentes cefalosporinas y un inhibidor suicida de ß-lactamasas, como el ácido clavulánico. En este estudio se utilizaron cuatro discos combinados: cefpodoxima/ácido clavulánico (CD01) (10/1µg); ceftazidima/ácido clavulánico (CD02) (30/10µg); cefotaxima/ácido clavulánico (CD03) (30/10µg); y cefpiroma/ácido clavulánico (CD04) (30/7,5µg), de la casa comercial Oxoid, Basingstoke, UK. La confimación de la producción o no de BLEE se realiza midiendo el diámetro de inhibición producido por el microorganismo, el cual debería ser mayor o igual (>) a 5 mm por encima del halo de inhibición mostrado cuando el antimicrobiano es usado individualmente (sin la combinación del ácido clavulánico). 

Por otra parte, para el método de E-test (Epsilometer-test) (AB Biodisk, Suecia) se utilizaron tiras de material no poroso, que contiene el antimicrobiano en estudio y el antimicrobiano combinado con ácido cluvulánico en un gradiente de concentración, lo que permite determinar la CIM. Para ello se preparó un inóculo estandarizado, igual que para la determinación de susceptibilidad por el método de difusión de disco. Seguidamente se procedió a colocar las tiras de E-test que contenían la combinación de CAZ y CAZ/ácido clavulánico con rangos de CIM de 32 - 0,50 µg/ml y de 4 - 0,064 µg/ml, respectivamente; también se utilizó la tira de CTX y CTX/ácido clavulánico con rango de CIM de 16-0,25µg/ml y 1-0,016 mg/mL, respectivamente. La CIM estuvo determinada en el punto en que la elipse de inhibición intercepta la escala de la tira. Para confirmar la producción de BLEE se obtiene la razón de dividir la CIM del antimicrobiano solo por la CIM del antimicrobiano con ácido clavulánico; si esta razón es igual a 8, se confirma la producción de BLEE (24).

Adicionalmente, se utilizó el método de sinergia del doble disco; ésta se realizó siguiendo la metodología descrita por Jarlier y cols., (1988) (29). En esta prueba se colocó un disco de amoxicilina/ácido clavulánico en el centro de una placa de Petri, y alrededor de este se colocaron discos de CAZ, CRO, CTX, CPO y ATM a 20 mm de distancia del disco central. La presencia de BLEE se manifiesta por el efecto sinérgico del inhibidor (efecto tapón de corcho), bajo la forma de ampliación del halo en uno o varios de los ß-Lactámicos (24, 30-32).

RESULTADOS

Al utilizar el método de difusión del disco en agar para clasificar las cepas como posibles productoras de BLEE, el 22,30% de las cepas de E. coli y el 40,30% de las de K. pneumoniae fueron sospechosas de producir BLEE. Al confirmar estos resultados a través del método del disco combinado (CD01, CD02, CD03 y CD04), se obtuvo que de las 29 cepas de E. coli, 25 fueron positivas (86,20%), mientras que para K. pneumoniae, 26 de 27 fueron positivas (96,30%). La Figura 1 muestra la prueba del disco combinado positiva.

Figura 1. Prueba del disco combinado. Se puede observar  que la diferencia de tamaño entre el disco de ceftazidima y el de ceftazidima/ácido clavulánico es mayor de 5 mm.

Por otra parte, al utilizar como indicador el método de CIM por el método de dilución en agar, el 19,23% de las cepas de E. coli y el 38,80% de las cepas de K. pneumoniae resultaron sospechosas de producción de BLEE. Estos resultados se confirmaron utilizando el método de E-test, observándose un 100% de concordancia entre estas dos pruebas. La Figura 2 muestra una prueba de E-test positiva para la producción de BLEE

Figura 2. Prueba de E-test positiva. La razón de dividir la CIM de cefotaxima (CT) entre la de cefotaxima/ácido clavulánico (CTL) es mayor de 8. Nótese el efecto fantasma que se produce en el centro de la tira, producto de la sinergia entre el antibiótico y el ácido clavulánico.

Al utilizar el método del doble disco propuesto por Jarlier y col. (29) se observa que 25 (19,23%) de las cepas de E. coli y 26 (38,80%) de las de K. pneumoniae resultaron productoras de BLEE (Figura 3). La Tabla 1 resume todos los resultados obtenidos.

Figura 3. Método del doble disco positivo. Obsérvese el efecto sinérgico (tapón de corcho o distorsión de los halos de inhibición) que se produce entre los discos de ceftriaxona /CRO), cefotaxima (CTX) y aztreonam (ATM) con el disco central de amoxicilina/ácido clavulánico (AMC)

Tabla 1. Identificación de las cepas de E. coli y K. pneumoniae estudiadas para la producción de BLEE, por los diferentes métodos empleados.

DISCUSIÓN

Todos los métodos utilizados en esta investigación fueron capaces de detectar cepas productoras de BLEE.  Ninguno de los resultados obtenidos por los distintos métodos mostró diferencias significativas al ser analizados estadísticamente (p>0,05); este hecho sugiere que se puede emplear cualquiera de ellos para determinar la producción de BLEE.

Similares resultados se observaron en el trabajo realizado por Dos Santos, A. y cols., 2003 (33), en el que no encontraron diferencias significativas al comparar la sensibilidad y especificidad entre los métodos ensayados. De la misma manera, un estudio realizado por Ho, P y cols., 1998 (34), comparó estos métodos para la detección de BLEE, y demostró un 100% de sensibilidad y especificidad.

Estos resultados difieren con el reportado por Martínez y cols., 2003 (35), quienes señalan como más sensible el método del disco combinado, basando su análisis en la interpretación cualitativa de los resultados, ya que para los otros métodos empleados se presentaron mayores dificultades para la interpretación por las medidas de los diámetros estandarizados.

En esta investigación es importante resaltar el hecho de que un número importante de cepas de E. coli y K. pneumoniae son capaces de producir BLEE; estos resultados se corresponden con los descritos por diversos autores a nivel regional y mundial (10, 34, 36-39), los cuales también han reportado importantes porcentajes en la producción de BLEE por estas cepas.

Al comparar los porcentajes de producción de BLEE de estos microorganismos, se evidencia que K. pneumoniae fue el más importante. Esto se debe probablemente a la capacidad de este microorganismo de desarrollar competencia de manera natural, lo cual le confiere cierta ventaja adaptativa respecto a E. coli, para el cual no se ha reportado esta capacidad. La competencia en las cepas de K. pneumoniae favorece la adquisición, con cierta facilidad, de determinantes genéticos de resistencia (plásmidos, transposo nes, integrones) (31, 40, 41).

A nivel nacional, el Grupo Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana (GVRB) refiere porcentajes de resistencia más elevados en las cepas de K. pneumoniae que las cepas de E. coli (42), lo cual podría ser consecuencia de la presencia de genes de resistencia (plásmidos) encontrados en mayor proporción en estas cepas. Los plásmidos poseen segmentos que sirven para codificar la capacidad de integrarse en forma específica a los sitios de captura de genes de resistencia (14, 43). A nivel regional, el Centro de Referencia Bacteriológica del SAHUM (32) reporta mayores índices de resistencia a los antimicrobianos en cepas de K. pneumoniae que en cepas de E. coli.

Podemos concluir que los métodos utilizados en esta investigación no demostraron diferencias significativas de desempeño para la detección de BLEE, por lo que podría utilizarse cualquiera de ellos en el laboratorio clínico; los métodos basados en la determinación de la CIM (dilución en agar y E-test) son los más sensibles y específicos, pero tienen la desventaja de ser difíciles de aplicar rutinariamente a todos los aislamientos de un laboratorio de Bacteriología. Aunado a esto, se deben tomar en cuenta los costos operativos: estas pruebas son costosas, especialmente las tiras de E-test, lo que recargaría el costo de los cultivos. Los métodos basados en difusión del disco (Baüer/Kirby y disco combinado) son mucho más económicos y fáciles de realizar en un laboratorio de rutina. La principal dificultad de los discos combinados es su adquisición, ya que pocas casas comerciales distribuyen estos discos a nivel local.

Además de los métodos estandarizados y aprobados por el NCCLS, en esta investigación se utilizó el método del doble disco propuesto por Jarlier y col., (29). Este método es una adaptación creada por Jarlier para simplificar el trabajo del laboratorio en la detección de BLEE; demostró ser tan sensible y específico como los métodos estandarizados. Este método ofrece una alternativa viable para los laboratorios de rutina, ya que utiliza la misma técnica y los mismos discos de un antibiograma de rutina. La única diferencia es la forma en que se deben colocar los discos en la placa.

Todos los métodos aquí ensayados son aceptables para la detección fenotípica de la mayoría de las cepas de E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEE; su utilización dependerá de las condiciones de cada laboratorio. Es importante resaltar que, sin importar el método que se utilice, se debe realizar de rutina la detección de cepas de E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEE, especialmente en los pacientes hospitalizados en nuestras instituciones de salud, ya que se ha demostrado que están presentes en nuestro medio y ocasionan serios problemas de infecciones nosocomiales.

AGRADECIMIENTOS

Al todo el personal del Laboratorio de Bacteriología de la Escuela de Bioanálisis y del CRB del SAHUM, Maracaibo, estado Zulia, así como al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de La Universidad del Zulia, por el apoyo financiero para la realización de esta investigación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Fleites A, Venero P, Cahue G, Sierra G, Castillo M, Santos M. Detección de β-lactamasas de espectro extendido en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae de origen hospitalario y ambulatorio. Enferm Infecc Microbiol Clin 2002; 20 (Suppl 1): 77-82.        [ Links ]

2. Mandell G, Dolin G, Bennett J. Enfermedades infecciosas, principios y práctica. 5ta edición Editorial Médica Panamericana. 2002, p. 227.        [ Links ]

3. Wong A, Hindler J, Loeloff M, Queenan A, Lee N, Pegues D, Quinn J, Bush K. Molecular correlation for the treatment outcomes in bloodstream infections caused by Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae with reduced susceptibility to ceftazidime. Clin Infec Dis 2002; 34: 135-46.        [ Links ]

4. Martínez L, Pascual A, Conejo M, García I, Joyanes P, Doménech A, Benedí V. Energy-dependent accumulation of norfloxacin and porin expression in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and relationship to extended-spectrum b-Lactamase production. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46(12): 3926-32.        [ Links ]

5. Tan B, Tan A. Community-acquired bacteremia with an ESBL-producing Escherichia coli strain - a case report. Int J Dis 2002; 6: 318-9.        [ Links ]

6. Livermore D, Brown D. Detection of β-lactamase-mediated resistance. J Antimicrob Chemother 2001; 48(Suppl S1): 59-64.        [ Links ]

7. Rice L. Successful interventions for gram-negative resistance to extended-spectrum b-lactamic antibiotics. Pharmacoterapy 1999; 19: 120S-128S.        [ Links ]

8. Spanu T, Luzzaro F, Perilli M, Amicosante G, Toniolo A, Fadda G, and the Italian ESBL Study Group. Ocurrence of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae in Italia: Implications for resistance to β-lactams and other antimicrobial drugs. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46(1): 196-202.        [ Links ]

9. Wong B. Therapeutic challenges associated whit extended-spectrum, β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Pharmacotherapy 2001; 21 (5): 583-92.        [ Links ]

10. Coudron P, Moland E, Thomson K. Ocurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center: seek and you may find. J Clin Microbiol 2002; 35(10): 2593-7.        [ Links ]

11. Pérez M, Miralles G, Romera G, Panisello M, Jardi A, Zarazoga J. Caracterización de la resistencia a asociaciones de β-lactámicos e inhibidores de beta-lactamasas en Escherichia coli. Influencia del tipo y nivel de producción de beta-lactamasas. Enferm Infecc Microbiol Clin 2002; 15: 477-81.        [ Links ]

12. Winokur P, Canton R, Casellas J, Legakis. Variations in the prevalence of strains expressing an extended-spectrum β-lactamase phenotype and characterization of isolates from Europe, the Americas, and the Western Pacific Region. Clin Infec Dis 2001; 32(Suppl 2): S94-S103.        [ Links ]

13. Araque M, Rivera I. Simultaneous presence of blaTEM and blaSHV genes on a large conjugative plasmad carried by extend-spectrum beta-latamase-producing Klebsiella pneumoniae. Am J Med Sci 2004; 327(3): 118-22.        [ Links ]

14. Carmona O, Silva H. Mecanismo de resistencia a los antimicrobianos. Bol Soc Ven Microbiol 1994; 13(1): 6-18.        [ Links ]

15. Hibbertrogers L, Heritage D, Gascoynebinzi P, Hawkey N, Todd I, Lewis J, Bailey C. Molecular epidemiology of ceftazidime resistant enterobacteriaceae from patient on pediatric oncology ward. J Antimicrob Chemother 1995; 36: 65-82.        [ Links ]

16. Perozo A, Castellano M, Ginestre M, Ávila, Y. Determinación de β-lactamasas plasmídicas de espectro extendido (ESBL) en cepas de Escherichia coli  y Klebsiella pneumoniae. Memorias del Congreso Venezolano de Microbiología “Elsa La Corte Anselmi”. Sociedad Venezolana de Microbiología, Capítulo Zulia: 2000, 5-8 de Noviembre. p. 71.         [ Links ]

17. Jacoby G, Chow N, Waites K. Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance. Antimicrob Agents Chemother 1997; 47(2): 559-62.        [ Links ]

18. Koneman E, Allen D, Janda W, Schreckenberger P, Washington C. Diagnóstico microbiológico. (5ta. Edición). Editorial Médica Panamericana. 1999,  p. 763-832.        [ Links ]

19. Krontal S, Leibovitz E, Greenwald-Maimon M, Frases D, Dagan R. Klebsiella bacteremia in children in southern Israel 1988-1997. Infection 2002; 30:125-34.        [ Links ]

20. Medeiros A. Evolution and dissemination of β-lactamases accelerated by generations of  β-lactam antibiotics. Clin Infec Dis 1997; 24(Suppl 1): S19-S45.        [ Links ]

21. Paterson D, Ko W, Gottberg A, Casellas J, Mulazimoglu L, Klugman, K, Bonomo R, Rice L, McCormack J, Yu V. Outcome of cephalosporin treament for serious infections due to apparently susceptible organisms producing extended-spectrum β-Lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 2001; 39(6): 2206-12.        [ Links ]

22. Wu T, Siu L, Su L, Lauderdale T, Lin F, Leu H, Lin T, Ho M. Outer membrane protein change combined with co-existing TEM-1 and SHV-1 β-lactamases lead to false identification of ESBL-producing Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 755-61.        [ Links ]

23. Bonomo R. Multiple antibiotic-resistant bacteria in long-term-care facilities: An emerging problem in the practice of infectious Diseases. Clin Infec Dis 2000; 31: 1414-22.        [ Links ]

24. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standars). Antimicrobial susceptibility testing. Ninth Informational Supplement. Documento M100/S14. 2004, Vol. 24, Nº 1.        [ Links ]

25. Livermore D, Oakton K, Carter M, Warner, M. Activity of Ertapenem (MK-0826) versus Enterobacteriaceae with Potent β-Lactamases”. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(10): 2831-7.        [ Links ]

26. Schiappa D, Hayden M, Matushek M. Ceftazidima-resistant Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli bloodstream infections: a case-control and molecular epidemiologic investigation”. J Infect Dis 1996; 174: 529-37.        [ Links ]

27. Murray P, Baron E, Jorgensen J, Pfaller M, Yolken R. Manual of Clinical Microbiology. 8va ed. American Society for Microbiology. Washinton, DC. USA. 2003, Vol. 1. p. 384-404.        [ Links ]

28. Baüer A, Kirby W, Sherris J, Turk M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol 1996; 45: 439-96.        [ Links ]

29. Jarlier V, Nicolas M, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility pattern. Rev Infect Dis 1998; 10: 867-78.        [ Links ]

30. Ardanuy C, Linares J, Domínguez Hernández S, Benedí V, Martínez, L. Outer membrane profiles of clonally related Klebsiella pneumoniae isolates from clinical samples and activities of cephalosporins and carbapenems. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42(7): 1636-40.        [ Links ]

31. British Society for Antimicrobials and Chemsterapy (BASC). Disc Diffusion Method of Antimicrobial Susceptibility testing. Versión 3. 2004, Enero.        [ Links ]

32. Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (CRB-SAHUM). Boletín sobre Etiología y Resistencia Bacteriana. 5ta Edición. 2001, Maracaibo-Venezuela.        [ Links ]

33. Dos santos A, Rodríguez J, Bronharo M, Silva H. Avaliação da acurácia de testes laboratoriasis para detecção de amostras de Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido. J Brasileira Patol Med Lab 2003; 39(4): 301-8.        [ Links ]

34. Ho P, Chow K, Yuen K, Ng W, Chau P. Comparación of a novel, inhibitor-potentiated disc-diffusion test with other methods for the detection of extended spectrum b-lactamases in Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob Chemother 1998; 42: 49-54.        [ Links ]

35. Martínez P, Mercado M, Máttar S. Detección de ß-lactamasas de espectro extendido en gérmenes nosocomiales del Hospital San Jerónimo, Montería. Colomb Med 2003; 34(4): 196-205.        [ Links ]

36. Coudron P, Moland E, Sanders Ch. Ocurrence and detection of extended-spectrum β-lactamases in member of the family Enterobacteriaceae at a veterans medical center. J Clin Microbiol 1997; 35(10): 2593-7.        [ Links ]

37. Daoud Z, Hakime, M. Prevalence and susceptibility patterns of extended-spectrum betalactamase-producing Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae in a general university hospital in Beirut, Lebanon”. Rev Esp Quimioter 2003; 16(2): 233-8.        [ Links ]

38. De La Parte M, Brito A, Guzmán M, Carmona O, y Grupo Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana. Resistencia de Klebsiella pneumoniae a los antimicrobianos en Venezuela. Análisis de una década. Bol Soc Ven Microbiol 2001; 21(2): 14-22.        [ Links ]

39. Vercauteren E, Descheemaeker P, Ieven M, Sanders C, Goossens H. Comparison of screening methods for detection of extended spectrum β-lactamases and their prevalence among blood isolates of Escherichia coli and Klebsiella spp. in Belgian teaching hospital. J Clin Microbiol 1997; 35(9): 2191-7.        [ Links ]

40. Hernández J, Pascual A, Cantón R, Martínez L, Grupo de estudio de infección Hospitalaria (GEIH). 2003. “Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productores de betalactamasas de espectro extendido en hospitales españoles (Proyecto GEIH-BLEE 2000). Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21(2): 77-82.         [ Links ]

41. Poirel L, Naas T, Thomas I, Karim A, Bingen E, Nordmann, P. CTX-M type extended-spectrum β-lactamase that hydrolizes ceftazidime through a single amino a substitution in the omega loop. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(12): 3355-61.        [ Links ]

42. Inciarte L, Sanz L, Contreras R, Texeira G, Carmona O, y Grupo Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana. Resistencia de Klebsiella pneumoniae a los antimicrobianos en Venezuela. Bol Soc Ven Microbiol 1994; 15(1): 15-25.        [ Links ]

43. Castellano M, Gallegos B, Gallegos L, González M, Báez M. Concentración inhibitoria mínima de doce β-lactámicos por el método de E-Test en patógenos nosocomiales”. Bol Soc Ven Microbiol 1998; 6(3): 21-33.        [ Links ]