Atividade antimicrobiana de espécies de Penicillium mantidas sob duas condições de preservação

Josy, C. da Silva^a, Ormezinda C. C. Fernandes^b, Michel da S. Martins^a, Armando da C. Rodrigues Jr^c, Maria Francisca S. Teixeira^a,*

^a Programa de Pós-Graduação em Diversidade Biológica – UFAM/Micologia; Universidade Federal do Amazonas – UFAM.

^b ILMD/ FIOCRUZ – Laboratório de Biodiversidade.

^c Centro de Excelência; Ambiental da Petrobras – CEAP.

* Correspondencia: E-mail: mteixeira@ufam.edu.br

Resumo:

Neste trabalho foi investigada a viabilidade e atividade antimicrobiana de 60 Penicillium spp. preservados sob óleo mineral e água destilada esterilizada. Os fungos foram reativados em meios de cultura seletivos e autenticados conforme as características macro e micromorfológicas. A atividade antimicrobiana foi determinada pela técnica do bloco de gelose e bioautografia contra bactérias Gram positivas, bactérias Gram negativas, leveduras e Mycobacterium smegmatis. A viabilidade das culturas correspondeu a 46,7% para os preservados em água destilada e 43,3% para os preservados sob óleo mineral. Os testes de atividade antimicrobiana em meio sólido revelaram que Staphylococcus aureus e Candida albicans foram os mais susceptíveis aos compostos bioativos enquanto que Escherichia coli e Mycobacterium smegmatis, os mais inativos. Por bioautografia está demonstrando a atividade antimicrobiana dos constituintes químicos das espécies de Penicillium, resultado que abre novas possibilidades para identificação de compostos com potencial antifúngico e antibacteriano.

Palavras chave: Penicillium, preservação, viabilidade, atividade antimicrobiana

Actividad antimicrobiana de especies de Penicillium mantenidas bajo dos condiciones de preservación

Resumen:

En este trabajo se investigó la viabilidad y la actividad antimicrobiana de 60 Penicillium spp. conservados en aceite mineral y en agua destilada estéril. Los hongos fueron reactivados en medios de cultivos selectivos y verificados conforme a sus características macro y micromorfológicas. La actividad antimicrobiana fue determinada por las técnicas del bloque de agar y bioautografia contra bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, levaduras y Mycobacterium smegmatis. La viabilidad de los cultivos correspondió a 46,7% para aquellos conservados en agua destilada y a 43,3% para los conservados en aceite mineral. Las pruebas de actividad antimicrobiana en medio solido revelaron que Staphylococcus aureus y Candida albicans fueron los más susceptibles a los compuestos bioactivos mientras que Escherichia coli y Mycobacterium smegmatis, los más inactivos. Se demostró por bioautografía la actividad antimicrobiana de los componentes químicos de las especies de Penicillium, resultado que abre nuevas posibilidades para la identificación de compuestos con potencial antifúngico y antibacteriano.

Palabras clave: Penicillium, preservación, viabilidad, actividad antimicrobiana

Antimicrobial activity of Penicillium species kept under two preservation methods

Abstract:

In this study, we investigated the viability and antimicrobial activity of 60 Penicillium spp. conserved under mineral oil and sterile distilled water. The fungi were reactivated in specific culture media and verified according to their macro and micromorphologic characteristics. Their antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, yeasts, and Mycobacterium smegmatis was determined by the agar block and bioautography techniques. Viability of cultures corresponded to 46.7% for those conserved in distilled water and 43.3% for those conserved in mineral oil. The antimicrobial activity in solid media revealed that Staphylococcus aureus and Candida albicans were the most susceptible to the bioactive components, while Escherichia coli and Mycobacterium smegmatis the most inactive. The antimicrobial activity of the chemical components of the Penicillium species was demonstrated through bioautography; these results open new possibilities for the identification of components with antifungal and antibacterial potential.

Keywords: Penicillium, preservation, viability, antimicrobial activity

Recibido 20 de julio de 2009; aceptado 15 de marzo de 2010

Introdução

Penicillium constituem um grupo de microrganismos que sintetizam elevada quantidade de metabólitos secundários, atingindo em certos casos, uma produção 73% superior a de outras classes de microrganismos [1]. Estes fungos anamorfos são representados por aproximadamente 225 espécies com 347 sinonímias, além dos teleomorfos, Eupenicillium (45 espécies) e Talaromyces (24 espécies) [2-4].

Espécies de Penicillium têm uma alta diversificação, tanto morfológica quanto de metabólitos secundário, a exemplo de antibióticos, micotoxinas, antioxidantes, anticancerígenos, inseticidas, herbicidas, enzimas e fungicidas [5-8].

Rancic e col. [9] reportam que existe um grande número de extratos de fungos e/ou produtos extracelulares com atividade antimicrobiana, sobretudo de espécies de Penicillium sp. Entre outros, P. brevicompactum, P. carneus, P. citrinum, P. crhysogenum, P. dipodomyis, P. flavigenum, P. funiculosum, P. griseofulvio, P. nalgiovense, P. nordicum, P. persicinum são espécies relatadas como fontes de antibióticos, especialmente de penicilina e griseofulvina [2,3,10,11].

Portanto, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se fundamental a investigação dos compostos que possam atuar como novos antimicrobianos no tratamento de doenças infecciosas que causam um número considerável de mortes. Além disso, o aumento da quantidade de pessoas que têm doenças imunossupressoras ou metabólicas, o fenômeno crescente da resistência bacteriana e efeitos colaterais de certos medicamentos antimicrobianos, contribuem para efetivação de estudos que direcionem à descoberta de novos antimicrobianos [12-15].

Dado o crescente estabelecimento dos microrganismos no desenvolvimento de compostos de importância industrial, a conservação em coleções de culturas torna-se uma alternativa essencial para manutenção de sua integridade metabólica, condição fundamental para que estes sejam disponibilizados como material de referência para estudos futuros, inclusive para prospecção de compostos metabólicos de interesse biotecnológico [16,17].

Entre os métodos propostos para conservação os comumente utilizados, nas coleções de microrganismos, são óleo mineral [18], água destilada [19], esporos em areia [20], sílica gel [21], por liofilização [22] e em nitrogênio líquido [23]. Entretanto, o método a ser adotado depende da espécie a ser preservada e dos recursos que dispõe na coleção [24].

Nesse contexto esta pesquisa teve como objetivo verificar a viabilidade morfológica e a atividade antimicrobiana de espécies de Penicillium da Coleção de Cultura DPUA, preservadas sob óleo mineral e em água destilada esterilizada.

Material e métodos

Microrganismos: Para este estudo analisaram-se 60 culturas de Penicillium (Tabela 1), representadas por 30 espécies preservadas por 3 a 17 anos, em água destilada esterilizada (n=30) e óleo mineral (n=30), estocadas na Coleção de Culturas DPUA, do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas-UFAM.

Tabela 1. Espécies de Penicillium selecionadas para o estudo da viabilidade, preservadas por diferentes períodos de estocagem em água destilada esterilizada e sob óleo mineral na Coleção de Culturas DPUA.

Reativação das culturas preservadas: Das culturas preservadas em água destilada esterilizada foram retiradas frações e transferidas para tubo de ensaio contendo meio de cultura inclinado ágar extrato de levedura Czapek (CYA), ou caldo glicosado (CG) [25]. Os cultivos foram mantidos a 25^oC por sete dias.

Autenticação das culturas em nível de espécie: Para confirmação das características macroscópicas, fragmento de cultura das espécies de Penicillium crescidas em meio de cultura CYA e CG pura, foram transferidas para ágar extrato de malte (MEA), ágar glicerol nitrato 25% (p/v) (G25N) e CYA, em placa de Petri (10 mm x 90 mm), mantendo-se os cultivos a 25^oC, por sete dias. As microestruturas foram observadas em lâmina obtidas por microcultivo. Para o reconhecimento das características da espécie foram utilizadas metodologias descritas por Pitt [26].

Determinação da atividade antimicrobiana: A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pelo método do bloco de gelose por difusão em ágar. Os microrganismos testados foram cultivados em ágar Sabouraud (VETEC, Brasil), a 25^oC por 48 horas (Candida albicans DPUA 1340) e em ágar Müeller-Hinton (MERK, Alemanhã), a 37^oC por 24 horas (Staphylococcus aureus CCT 1352, Escherichia coli CCT 0547 e Mycobacterium smegmatis PDUFPE-71). Nesses cultivos foi preparada uma suspensão celular de concentração semelhante à coluna n^o1 da escala de MacFarland. De cada suspensão, 100 µL foram retirados para serem semeados na superfície ágar Sabouraud e ágar Müeller-Hinton, em placa de Petri (10 mm x 90 mm), formando uma camada uniforme. Nesses cultivos foram sobrepostos três discos com 5 mm de diâmetros retirados da área central das culturas de Penicillium crescidas em CYA [27]. As placas foram incubadas em estufa a 25^oC e 37^oC por 24 e 48 horas, respectivamente. Como padrão foi utilizado Itraconazol e Rifampicina [MERCK, Alemanha (0,005 mg/mL)]. A atividade antimicrobiana foi avaliada medindo-se o halo de inibição.

Extração dos biocompostos: Os Penicillium foram cultivados em CYA, a 25 ^oC, e após sete dias foram retirados discos do centro da colônia para extração a frio dos biocompostos em hexano. Ao término dessa extração, no resíduo remanescente foi adicionado em acetato de etila, repetindo-se o procedimento com etanol 95%. Os extratos obtidos após 48 horas de extração foram filtrados em papel Whatman nº 30 e submetidos à concentração e redissolvidos com o solvente extrativo (500 µL) para determinação do perfil cromatográfico e atividade antimicrobiana.

Cromatografia em camada delgada (CCD) e bioautografia: Nos ensaios bioautográficos, em cada placa de CCD, (MERCK, Alemanha), foram aplicados com capilar para o padrão (itraconazol e rifampicina, 0,005 mg/mL) e os diferentes extratos orgânicos. As placas foram desenvolvidas no sistema de eluição -hexano/acetato de etila (Nuclear, Brasil 6:4 v/v)-, e secas; a revelação dos biocompostos foi realizada sob luz ultravioleta para identificação dos metabólitos secundários e os respectivos Rf foram determinados nas bandas visualizadas.

Para determinação da atividade antimicrobiana por bioautografia, em condições assépticas, 20 mL (ágar Müeller-Hinton ou ágar Sabouraud), mantidos a 40ºC contendo 500L de suspensão celular de cada microrganismo testado e 500L de cloreto de trifeniltetrazoliun-TCC 1% p/v (MERCK, Alemanha) foi vertido na cromatoplacas acondicionadas em placa de Petri medindo 120 mm x 9 mm. Após solidificação do meio, as placas foram incubadas a 25^oC e 37^oC por 24 e 48 horas, respectivamente. A atividade antimicrobiana foi avaliada visualizando-se a área de inibição [14,27,28].

Análise estatística: Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva no Programa Excel Versão 7.0. A seleção das espécies para os ensaios bioautográficos foi avaliada pela análise de cluster (Método de Ward), e a distância de City-Blocks (Manhattan Distância), foi usada para avaliar os valores do diâmetro médio do halo de inibição em milímetros das espécies estudadas [29]. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Resultados

A tabela 1 apresenta os dados referentes à viabilidade de 60 culturas de Penicillium preservadas em água destilada esterilizada e sob óleo mineral, do acervo da Coleção de Cultura DPUA. Do total de fungos examinados, as taxas de viabilidade foram de 46,7% (28/30) para aqueles preservados em água destilada e 43,3% (26/30) sob óleo mineral. A inviabilidade das preservadas em água destilada foi observada somente nas culturas com 14 e 16 anos (2/30, 3,3%) e em óleo mineral, naquelas estocadas por 12 (1/30, 1,7%), 15 (2/30, 3,3%) e 16 anos (1/30, 1,7%).

Os aspectos macro e micromorfológico das culturas viáveis (54/60, 90%) evidenciaram as distintas características do gênero Penicillium quando foram comparadas com a chave de classificação proposta por Pitt [26]. Dos 60 Penicillium, representadas por 30 espécies, aqueles preservados sob óleo mineral, que não apresentaram crescimento nas condições experimentais foram P. citrinum DPUA 620, P. citrinum DPUA 507, P. janthinellum DPUA 645, P. variabile DPUA 309, e, entre os preservados em água destilada esterilizada, apenas P. esclerotiorum DPUA 802 e P. olsonii DPUA 263. As espécies que cresceram, mas não apresentaram estrutura de reprodução foram P. citrinum DPUA 620, P. janczewskii DPUA 304 e P. steckii DPUA 306, todas preservadas em água destilada esterilizada.

Os resultados da atividade antimicrobiana em meio sólido revelaram que 42,9% e 57,1% dos Penicillium (28/54) preservados sob óleo mineral e em água destilada esterilizada, respectivamente, expressaram halo de inibição contra um a três dos microrganismos-teste. Nos resultados citados na tabela 2, entre os preservados sob óleo mineral (12/28), a área de inibição foi observada somente em S. aureus CCT 1352 e C. albicans DPUA 1340.

Tabela 2. Atividade antimicrobiana, por difusão em ágar, de espécies de Penicillium preservadas sob óleo mineral e água destilada.

Ca: Candida albicans DPUA 1340; Ec: Escherichia coli CCT 0547;

Ms: Mycobacterium smegmatis PDUFPE-71;

Sa: Staphylococcus aureus CCT 1352;

I=inativo (não houve desenvolvimento do halo de inibição).

Quanto aos Penicillium preservados em água destilada esterilizada (16/28) (Tabela 2), as espécies que inibiram C. albicans, M. smegmatis, S. aureus foram P. janczewskii DPUA 304, P. steckii DPUA 306, P. paxilii DPUA 793, P. puberulum DPUA 1146, sendo que o diâmetro dos halos apresentou variação de ± 7,0 mm a ± 28,0 mm. Neste contexto, E. coli CCT 0547 (Ec) foi sensível somente a quatro espécies de Penicillium (P. decumbens DPUA 559, P. montanenses DPUA 1533, P. paxilii DPUA 938 e P. rugulosum DPUA 543).

Das culturas (28/54) submetidas aos testes de antibiose, sete [três de óleo mineral (halo≥ ±16,6 mm) e quatro preservadas em água destilada (halo≥ ±24,6 mm)] que demonstram os maiores halos foram selecionadas para os ensaios de bioautografia. Entre os extratos brutos (hexano, aceto de etila e etanol 95%), a melhor definição das bandas foi observada no extrato acetato de etila, proporcionado pelo sistema de eluição hexano/acetato de etila 6:4. C. albicans DPUA 1340 foi sensível aos biocompostos presentes nos extratos acetato de etila de P. miczynskii DPUA 1406 (Rf 0,69, 0,81 e 0,92), P. decumbens DPUA 483 (Rf 0,92), P. paxilii DPUA 793 (Rf 0,65, 0,81 e 0,84) e P. puberulum DPUA 1146 (Rf 0,64, 0,78 e 0,89) (Tabela 3).

Tabela 3. Bioautografia de espécies de Penicillium que apresentaram maiores halos de inibição nos testes por difusão em ágar.

Ca: Candida albicans DPUA 1340; Ec: Escherichia coli CCT 0547;

Ms: Mycobacterium smegmatis PDUFPE-71;

Sa: Staphylococcus aureus CCT 1352;

I=inativo (não houve desenvolvimento do halo de inibição);

S=sensível (houve desenvolvimento do halo de inibição).

A tabela 3 também está mostrando que os compostos de P. rugulosum DPUA 543 (Rf 0,57 e 0,65) inibiram E. coli CCT 0547; P. paxillii DPUA 793 (Rf 065, 0,69, 0,70, 0,76 e 0,78) para M. smegmatis PDUFPE-71 e S. aureus CCT 1352. Este último microrganismo-teste também foi inibido por compostos de P. puberulum DPUA 1146 (Rf 0,50, 0,69 e 0,80), P. janczewskii DPUA 304 (Rf 0,47, 0,65 e 0,72) e P. commune DPUA 296 (Rf 0,47, 0,64 e 0,72).

Discussão

As citações disponíveis na literatura acerca dos métodos empregados na preservação e os respectivos efeitos na diversidade de fungos mostraram que não existe uma técnica padrão a qual seja capaz de preservá-los de forma adequada e generalizada [24,30-32]. Portanto, na escolha de um método para preservação de um determinado grupo de fungo, deve ser levada em consideração a capacidade de manutenção das características fenotípicas, genotípicas e patogênicas das culturas estocadas [21,33].

Os resultados obtidos neste estudo da avaliação das características morfofisiológicas, para se conhecer os possíveis efeitos causados pelos métodos de preservação em água destilada esterilizada e sob óleo mineral, mostraram que, entre as 60 culturas de Penicillium examinadas, 90% mantiveram as características morfológicas, semelhantes ás descrições de Pitt [26], além de excretarem substâncias com atividade antimicrobiana. Estes dados corroboram com os obtidos por outros autores [31,33-38] nos estudos realizados com fungos anamorfos preservados sob água destilada e óleo mineral.

Nos resultados da reativação das culturas preservadas em água destilada esterilizada e óleo mineral [19] verificou-se que estes foram métodos eficientes na manutenção da viabilidade e preservação das características macro e micromorfológicas dos Penicillium. Provavelmente, a predominância da viabilidade das culturas esteja relacionada à ausência de subcultivo, a idade do inóculo e à permanência do micélio em estado de latência, condições as quais auxiliam na diminuição de mutações [39].

Esses resultados estão em consonância com os citados na literatura a exemplo de espécies de Fusarium que sobreviveram de 4 a 35 anos [24] e Penicillium e Aspergillus, 32 anos [21]. Outros autores também relatam a eficácia desses métodos de preservação, mas destacam que se trata de um processo laborioso, exigindo a supervisão constante de forma a evitar efeitos que podem alterar as culturas preservadas [21,24, 40-41].

Os métodos de preservação avaliados neste estudo são os mais práticos, economicamente viáveis e têm sido usados para diferentes microrganismos, embora haja risco de contaminação e a estabilidade genética possa ser comprometida [21,40].

Em 2006, Borman e col. [36] citam que diversas pesquisas têm sido realizadas para viabilizar métodos para manutenção de fungos por longos períodos. Contudo, a maioria das técnicas tem procurado estender a longevidade das culturas, de forma a manter as características fisiológicas, incluído patogenicidade e produção de substâncias de interesses comerciais (enzimas, aflatoxinas, polissacarídeos, pigmentos, etc).

Além das análises acerca da ação dos métodos de preservação sobre Penicillium, foi realizado o screening de espécies produtoras de substâncias com atividade antimicrobiana. O resultado mostrou que das 54 culturas de Penicillum viáveis, mantidas em água destilada (n=28) ou sob óleo mineral (n=26), 52% apresentou efeito inibitório contra um ou mais microrganismos testes. E entre essas culturas, 22% foram oriundas de óleo mineral e 32% de água destilada, observando-se assim o efeito desses métodos na produção de biocompostos com atividade antagônica, sem desconsiderar as condições nutricionais, ambientais e a natureza dos fungos fundamentais na produção de metabólitos secundários [42-45]. Em 2005, Bérdy [46], também descreve a potencialidade de Penicillium e Aspergillus na produção de metabólitos antimicrobianos, como fontes de 1000 antibióticos. Ressalta também que os fungos e os actinomicetos são de igual importância em relação à produção de biocompostos para uso medicinal.

A atividade antimicrobiana também foi detectada por bioautografia, que foi realizada com sete extratos orgânicos de Penicillium para identificar os constituintes responsáveis, pela atividade antimicrobiana contra os microrganismos-teste. Nestas análises, utilizaram-se somente os extratos acetato de etila por ter apresentado o maior quantitativo e a melhor definição das bandas nos cromatogramas de referência em relação aos extratos hexano e etanol.

Nos bioautogramas, observou-se que a maioria dos extratos apresentou atividade para bactérias Gram-positivas, Gram-negativa e C. albicans. A atividade observada para os três grupos de microrganismos pode ser atribuída, entre outros fatores, a eficiência dos métodos na manutenção das espécies de Penicillium [47].

Para explorar o potencial desses extratos como protótipos de novos fármacos, na terapia de doenças infecciosas causadas por microrganismos multi-resistentes a drogas, é preciso realizar estudos adicionais sobre constituintes ativos que expressaram atividade antimicrobiana.

Conclusões

Comprovou-se que os métodos de preservação estudados são eficientes para garantir a viabilidade, pureza e autenticidade das espécies de Penicillium. Entre os métodos de avaliação da atividade antimicrobiana, os biautográficos confirmam e revelam com eficácia os diferentes compostos extracelulares com atividade frente a M. smegmatis, S. aureus, E. coli e C. albicans.

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