Marla Paredes, Mait Velásquez, Germán Fraile.

Laboratorio 5 Sección bioquímica farmacológica Instituto de Investigaciones Biomédicas BIOMED UC, Universidad de Carabobo, Maracay, Venezuela

Correspondencia: Marla Paredes E-mail: marlaalej@hotmail.com

La apoptosis de los neutrófilos (PMNs) es un evento crítico para controlar la fase de resolución de las inflamaciones. En tal sentido, la inducción farmacológica de la apoptosis mediante el empleo de antibióticos podría ser una opción terapéutica para tratar diversas enfermedades. Sin embargo, existe poca información acerca de las capacidades de los antibióticos de amplio espectro tales como las fluoroquinolonas, para acelerar la apoptosis en esas células. Entonces, en este estudio se propuso evaluar los efectos de las fluoroquinolonas ciprofloxacina (CPX) y norfloxacina (NFX) sobre la apoptosis de PMNs humanos in vitro. Métodos: Los PMNs aislados fueron incubados con ambas drogas para determinar sus efectos sobre la inducción de la apoptosis, la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) y el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) mediante técnicas de microscopía (óptica o de fluorescencia), luminometría y citometría de flujo, respectivamente. Resultados: A las concentraciones de 300 y 600 μmol/L, ambas drogas indujeron tanto el colapso del Δψm como la muerte por apoptosis de modos estadísticamente significativos. Además, esos efectos probablemente dependieron de la generación de una situación de estrés oxidativo debido a que ambas drogas incrementaron la generación de ERO intracelulares y sus efectos proapoptóticos fueron parcialmente bloqueados por la catalasa y por el lipopolisacárido (LPS). Conclusión: Estos hallazgos sugirieron que, debido a sus bajas toxicidades y a sus capacidades para inducir efectos apoptóticos en PMNs, tanto la CPX como la NFX pueden ser útiles para tratar enfermedades inflamatorias no necesariamente relacionadas con infecciones bacterianas.

Palabras Clave: Neutrófilos, apoptosis, ciprofloxacina, norfloxacina

Keywords: Neutrophils, apoptosis, ciprofloxacin, norfloxacin

Recibido: Febrero 2011 Aceptado: Julio 2011

La inducción de la apoptosis en las células pro-inflamatorias tales como los PMNs, es un evento que puede ser necesario para acelerar la exitosa resolución de una respuesta inflamatoria (1). Entre los fármacos que pueden ser buenos candidatos para alcanzar ese objetivo, destacan las fluoroquinolonas CPX y NFX debido a que son relativamente bien toleradas y en particular, se ha observado que ambas drogas penetran y se acumulan rápidamente en el interior de los PMNs alcanzando valores entre 4 y 6 para el cociente de concentraciones intra y extracelular (IC/EC) (2). Además, existe la posibilidad de que estos fármacos generen situaciones de estrés oxidativo debido a que se ha reportado que la NFX es capaz de estimular la quimioluminiscencia (QL) dependiente del luminol en macrófagos peritoneales de ratón, mientras que en PMNs humanos incrementó la fluorescencia de diclorofluoresceín diacetato (DCFH-DA), un detector de H2O2 intracelular (3). Por otro lado, en diversos tipos celulares se ha observado que el tratamiento in vitro con la CPX o la NFX a concentraciones mucho mayores que las necesarias para combatir infecciones, inhibe la proliferación e induce apoptosis en células humanas provenientes de: carcinomas pulmonares (4), carcinoma de vejiga (5), cáncer de próstata (6), carcinoma de colon (7) y células T leucémicas (8).

Además, se ha observado que tanto la CPX como la NFX inducen efectos apoptóticos mediante desestabilización de los lisosomas en las células HeLa (una línea de células de carcinoma cervical) antes de provocar la permeabilización de la membrana mitocondrial y la posterior muerte por apoptosis (9). A pesar de la importancia de todos esos factores (acumulación intracelular, desestabilización lisosomal, alteración mitocondrial y generación de H₂O₂ intracelular) como potenciales inductores de muerte celular, no se han publicado estudios relacionados con los efectos de las fluoroquinolonas sobre la apoptosis de PMNs humanos. Por esas razones, utilizando concentraciones similares a las empleadas en los ensayos contra células tumorales y en ausencia de infección y de agentes pro-inflamatorios, el propósito de este trabajo fue evaluar los efectos de la CPX y la NFX sobre la apoptosis de PMNs humanos en experimentos in vitro.

Materiales y métodos. Las drogas ciprofloxacina y norfloxacina fueron donadas por el Dr. Franklin Vargas del Centro de Química del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). El kit MitoScreen (JC-1) para detectar el potencial de membrana mitocondrial fue adquirido en BD Biosciences Pharmingen (San Diego, USA). El resto de los reactivos se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, USA) sin purificación adicional.

Aislamiento de los PMNs humanos de sangre periférica, Los PMNs fueron aislados a partir de sangre periférica de individuos donantes aparentemente sanos (previo consentimiento informado de los mismos). Las muestras fueron colectadas en tubos con EDTA al 1%, los PMNs fueron aislados e inmediatamente utilizados en cada uno de los ensayos. Se realizó el aislamiento utilizando un método estandarizado de centrifugación diferencial a distintas velocidades, basado en la lisis de los eritrocitos con una solución isotónica de cloruro de amonio (155 mmol/L), seguida por dos centrifugaciones en HBSS (Solución balanceada de Hank’s) para separar los neutrófilos siguiendo un método previamente descrito (10).

Determinación de Necrosis y apoptosis de PMNs.La determinación de necrosis se realizó por el método de exclusión del azul trípano, el cual se basa en el hecho de que una célula necrótica es incapaz de excluir de su citoplasma el colorante azul trípano, debido a que ha perdido la integridad de su membrana plasmática, lo que permitiría su identificación a través de la microscopía óptica. Para ello se observaron las células al microscopio óptico con objetivo de 40X contando aquellas que resultaron necróticas (color azul) con respecto a un total de 100 células contadas (11).

Para determinar la apoptosis se evaluaron las células citocentrifugadas (Hermle Z323K, Alemania) y teñidas con Wright-Giemsa siguiendo la técnica previamente descrita (12) mediante análisis al microscopio óptico (con objetivo 40X, Axiolab, Zeiss, Alemania) se contaron 300 células/lámina en las cuales se identificaron los cambios morfológicos característicos de las células apoptóticas tales como la condensación y fragmentación de la cromatina, vacuolización y formación de protuberancias. Alternativamente, la apoptosis se determinó identificando los cambios nucleares ya mencionados empleando una técnica de microscopía de fluorescencia (con un objetivo de 40X; Leica Microsystems. Suiza) basada en el empleo de una mezcla de los colorantes naranja de acridina (NA) y bromuro de etidio (BE) lo cual permite diferenciar las células viables de las que no lo son gracias a la captación diferencial de ambos pigmentos y siguiendo, sin modificaciones, un protocolo previamente descrito (13). Adicionalmente se hicieron algunos experimentos incluyendo inhibidores de la apoptosis de los PMNs. Para ello, las células (10⁷ cel/mL) fueron incubadas durante 30 min en presencia y ausencia de las drogas a 37 °C y 5% de CO2, antes de agregar la catalasa (10.000 U/mL) o LPS de E. coli serotipo 055:B5 (1 μg/mL) y se incubaron por 24 horas. Posteriormente la determinación de apoptosis se realizó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para microscopía de fluorescencia.

Determinación del Potencial de Membrana Mitocondrial. Para detectar la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se siguieron estrictamente las instrucciones suministradas por el fabricante del kit BD™ MitoScreen (BD Biosciences, San Jose, CA). Para ello, los PMNs fueron incubados con 1,5 μM 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazolyl-carbocyanine iodide (JC-1) durante 15 min a 37ºC y 5% de CO2. Para las lecturas de fluorescencia se utilizó un citómetro de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA). El incremento de la fluorescencia verde en el canal FL-1 se correlacionó directamente con el colapso del ΔΨm como consecuencia del tratamiento con las fluoroquinolonas.

En este trabajo se evaluaron los efectos in vitro de la CPX y la NFX sobre eventos morfológicos y funcionales relacionados con la apoptosis de los neutrófilos. Los resultados obtenidos se describen a continuación.

Determinación de Necrosis y apoptosis de PMNs. La figura 1A destaca la baja toxicidad exhibida por ambos compuestos en todo el intervalo de concentraciones ensayado (3-600 µ mol/L), ya que en ningún caso se afectó la capacidad que tienen los PMNs de excluir el colorante azul tripano, indicando que no hubo pérdida de la integridad de la membrana plasmática en estas células. Por otro lado, las figuras 1B y 1C muestran los efecto de las drogas sobre la apoptosis de los PMNs, lo cual fue evidenciado a través de sus cambios morfológicos característicos tales como la condensación y fragmentación de la cromatina observadas tanto por microscopía de fluorescencia como por microscopía óptica. Es evidente que ambas técnicas arrojan resultados similares ya que las figuras indican efectos proapoptóticos significativos solamente a las concentraciones más elevadas de 300 y 600 µ mol/L.

Determinación del Potencial de Membrana Mitocondrial. Las mitocondrias de los PMNs son capaces de mantener su Δψm (1), lo que puede ser detectado mediante citometría de flujo a través de la tinción de las células con JC-1, un pigmento fluorescente que tiñe a las mitocondrias de acuerdo con su Δψ m. Las mitocondrias activas (con elevado Δψ m) acumulan al JC-1 bajo la forma de agregados rojos mientras que en las inactivas (con bajo Δψ m), el JC-1 permanece bajo la forma de monómeros que exhiben fluorescencia verde. Por tanto, el incremento relativo en la fluorescencia verde (emisión a 530 nm) es indicativo del colapso del potencial de membrana mitocondrial. La figura 2 muestra los resultados obtenidos después de tratar los PMNs con la (figura 2A) y la CPX (figura 2B). Se observó que tras 4 horas de incubación, las concentraciones más altas de ambas drogas mostraron un incremento significativo en el porcentaje de células con fluorescencia verde aumentada, lo que indica un incremento en el porcentaje de células con alteraciones en el potencial de membrana mitocondrial.

Estos resultados coinciden con los encontrados en las determinaciones de apoptosis, ya que el colapso del potencial de membrana mitocondrial sólo resultó significativo a las concentraciones en las cuales se observaron efectos proapoptóticos (figuras 1B y 1C).

Determinación de la generación de ERO por Quimioluminiscencia. Se realizaron ensayos de quimioluminiscencia dependiente de luminol y de lucigenina, de muy corta duración, con el fin de determinar la producción de ERO en neutrófilos tratados con la CPX y la NFX. Los resultados son mostrados en la figura 3. Las curvas representativas de QL versus tiempo obtenidas a través del luminómetro (Figura 3 A y C) muestran que tanto la CPX como la NFX estimularon la QL dependiente del luminol a las concentraciones en las cuales se observó su efecto proapoptótico.

Por el contrario, al determinar la QL dependiente de lucigenina se encontró (Figura 3 B y D) que las curvas de QL versus tiempo en las células tratadas fueron similares a las del control. El análisis estadístico de esas observaciones mostrado en las figuras 3E y 3G, revela que efectivamente, tanto la CPX como la NFX incrementan significativamente de un modo dosis-dependiente, la producción de ERO determinada por la QL dependiente del luminol, mientras que las figuras 3F y 3H muestran la ausencia de tales efectos cuando se empleó lucigenina como agente amplificador de la QL.

Este hallazgo es interesante ya que el luminol puede permear los PMNs y requiere de H₂O₂ para emitir su luminiscencia, mientras que la lucigenina no puede penetrar al interior celular, por lo que su luminiscencia depende de los oxidantes secretados, particularmente del anión superóxido (16). Estos resultados sugieren que el rápido incremento de la producción intracelular de H₂O₂ inducido por el tratamiento de los PMNs con la CPX y la NFX, puede traer como consecuencia la acumulación del H2O2 y un incremento concomitante en la apoptosis dependiente del estrés oxidativo. Esta posibilidad fue examinada mediante la evaluación de la apoptosis en experimentos de 24 horas en PMNs tratados con la CPX y la NFX a una concentración de 300 µ mol/L y co-incubados con catalasa, una enzima que cataliza la ruptura del H₂O₂. Los resultados obtenidos son mostrados en la figura 4, donde se observa que tanto la apoptosis espontánea como la acelerada por las drogas fueron revertidas significativamente, lo cual sugiere que ambas drogas son capaces de acelerar la apoptosis espontánea de los PMNs de un modo que depende parcialmente de la producción de ERO.

Con la finalidad de confirmar que una situación de estrés oxidativo inducido por la CPX y la NFX sea la causa de la apoptosis observada en los PMNs, se hicieron experimentos de 24 horas con PMNs tratados con las drogas a la concentración de 300 µ mol/L y co-incubados con LPS a una concentración de 1 µ g/mL. Esta idea tiene como fundamento algunos hallazgos publicados que demuestran que la incubación de neutrófilos murinos con LPS aumenta de modo significativo las actividades de las enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa endógenas (17). Los resultados se muestran en la figura 5.

Estos resultados refuerzan la posibilidad de que la apoptosis inducida por las fluoroquinolonas en PMNs sea al menos parcialmente debida a la generación de una situación de estrés oxidativo.

Esencialmente, ambas fluoroquinolonas mostraron efectos similares sobre los eventos relacionados con la apoptosis de los neutrófilos, los cuales se discuten en el siguiente orden: (a) Aceleración de la apoptosis espontánea, (b) Rápida inducción en la generación de ROS y (c) Despolarización de la membrana mitocondrial.

a.-Aceleración de la apoptosis espontánea: Los resultados obtenidos revelan que la aceleración de la apoptosis espontánea de los PMNs por estas drogas es, aunque estadísticamente significativa con respecto al control, relativamente modesta ya que los niveles de apoptosis de los controles oscilan entre 30 y 34% mientras que en presencia de estas fluoroquinolonas se alcanzaron niveles de apoptosis de aproximadamente 45%, tras 24 horas de incubación (figuras 1B y 1C). Sin embargo, debe notarse que al menos para la CPX, estos débiles efectos se han reportado en otros tipos celulares. Por ejemplo, en células de una línea linfoblastoide tratadas con la CPX 300 µ mol/L por 24 horas, se indujo hasta un 27% de apoptosis por encima del control (18), mientras que el tratamiento con CPX (300-1500 µ mol/L) de algunas células tumorales de cáncer colorectal durante el mismo tiempo de incubación, solamente indujo bajos efectos apoptóticos (7). En contraste, bajo idénticas condiciones, la proliferación y apoptosis en las células de una línea de cáncer hepático (HepG2) no fueron afectadas por la CPX, sugiriendo que existen mecanismos alternativos independientes de la actividad anti-topoisomerasa de CPX (7). Aunque el modo de acción de la CPX en células de mamíferos no ha sido aclarado, se ha sugerido que esos efectos se deben a la inhibición no selectiva de la síntesis del ADN mitocondrial con daños subsiguientes a las mitocondrias y conduciendo finalmente a la depleción del ATP intracelular (7). En cuanto a la NFX, solamente se han reportado efectos pro-apoptóticos significativos en células irradiadas con luz ultravioleta (9,17).

b.-Rápida inducción en la generación de ROS: Se ha demostrado que la NFX puede activar por sí sola a la enzima NADPH oxidasa incrementando la producción de ERO en macrófagos de ratones (3), lo que sugiere que la aceleración de la apoptosis en PMNs tratados con la CPX y la NFX (figura 1) podría estar vinculada con dicho efecto. Las figuras 3E y 3G confirman que efectivamente, en ausencia de activadores metabólicos tanto la CPX como la NFX pueden incrementar por sí solas la producción de ERO. Cabe destacar que dicha QL ha sido descrita como un fenómeno parcialmente intracelular que depende a su vez parcialmente de la producción de H2O2 (16). Suponiendo que las ERO procedan de la activación de la NADPH oxidasa de los PMNs, estos resultados son interesantes dado que no se detectó la actividad de la NADPH oxidasa de la membrana plasmática al emplear la lucigenina como sonda quimioluminiscente. Sin embargo, de acuerdo con los datos disponibles no se puede descartar la posibilidad de que otra fuente alternativa de producción de H2O2 diferente a la NADPH oxidasa y detectable por el luminol haya sido activada por estas drogas. La figura 4 apoya la idea de que la aceleración de la apoptosis de los PMNs por las fluoroquinolonas en estudio depende parcialmente de la generación de H2O2 debido a que tras la co-incubación de las células con catalasa

(una enzima que cataliza la descomposición del H2O2 en H2O y O2), tanto la apoptosis espontánea como la acelerada por las drogas fue revertida significativamente.

En ese mismo orden de ideas se observó que al igual que con la catalasa, la coincubación de las células con LPS fue capaz de revertir la apoptosis acelerada por las drogas en estudio. Estos resultados también pueden ser interpretados como una respuesta ante una situación de estrés oxidativo ya que, se ha demostrado que la incubación de neutrófilos murinos con LPS aumenta de modo significativo la actividad de las enzimas SOD y catalasa (17). Por otro lado, se ha reportado que tras emplear un análisis de microarreglos de expresión genética en PMNs humanos tratados con LPS, se indujo la expresión del gen de la SOD-2, que es la versión mitocondrial de la SOD (20), por lo que al parecer los efectos antiapoptóticos del LPS podrían estar relacionados con mecanismos de protección de la integridad mitocondrial.

c.-Despolarización de la membrana mitocondrial: El colapso del potencial de membrana mitocondrial y su consiguiente despolarización, se ha descrito como un evento bioquímico indicativo de apoptosis. Aunque hasta ahora no se han publicado trabajos que describan la despolarización de las mitocondrias en PMNs tratados con estas drogas, en otros tipos celulares se ha descrito tal efecto cuando se incuban con la CPX por varios días (21). Además, en células HeLa (una línea de células de carcinoma cervical), la incubación durante 8 horas con la CPX (~1000 µ mol/L) provocó el colapso del potencial de membrana mitocondrial, posterior a la permeabilización de la membrana lisosomal y la subsiguiente translocación de las catepsinas B y D hacia las mitocondrias (9) por lo que se ha sugerido que los lisosomas podrían ejercer un papel importante dentro del proceso apoptótico. Resulta notable que en los experimentos reportados acerca de microarreglos en PMNs tratados con LPS, la catepsina D fue una de las proteínas cuya expresión fue inhibida (20). Este hallazgo es muy revelador ya que se ha descrito en neutrófilos humanos, una nueva ruta proapoptótica en la cual la catepsina D es liberada desde los gránulos azurofílicos de un modo dependiente de las especies reactivas de oxígeno para activar directamente a la caspasa-8 (22). Tales hallazgos sugieren entonces que probablemente las catepsinas sean el punto de unión entre la producción de ERO y la despolarización de la membrana mitocondrial.

En conclusión, los resultados del presente trabajo indican que las fluoroquinolonas CPX y NFX, a concentraciones que no afectan la integridad de la membrana plasmática, son capaces de acelerar la apoptosis espontánea de los PMNs a través de mecanismos que probablemente involucran la generación de ERO intracelulares y la despolarización de la membrana mitocondrial. Estas propiedades sugieren que estas drogas podrían ser útiles en el tratamiento de enfermedades no relacionadas con infecciones bacterianas.