Pesquisa da existência de bactérias Gram negativas endofíticas potencialmente patogênicas para o homem em hortaliças provenientes de cultivos orgânicos

María Beatriz Riverón Acosta*, Luiz Gilherme Coimbra Duarte

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Laboratório de Microbiologia. Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo. Brasil.

* Correspondencia: E-mail: mariabeatriz.acosta@mackenzie.br

Recibido 10 de marzo de 2014; aceptado 21 de julio de 2014

Introdução

A importância da existência dos microrganismos é algo indiscutível, sem estes, as formas de vida superiores não poderiam ter surgido, nem mesmo se mantido. Têm papeis fundamentais no planeta que habitamos, pois existem importantes interações entre microrganismos e animais e microrganismos e plantas, e com o homem, tanto na reciclagem de nutrientes chaves como na degradação de matéria orgânica, podendo essa interação ser muito benéfica ou extremamente prejudicial para seus hospedeiros [1].

Uma parcela de microrganismos, principalmente bactérias e fungos, habita o interior das plantas. São os endofíticos, colonizando os tecidos sadios das partes aéreas da planta, em alguma fase do seu ciclo de vida, sem lhe causar danos aparentes. Este conceito é também estendido aos microrganismos das raízes. Os endofíticos diferem dos epífitos que vivem na superfície dos vegetais, e dos fitopatogênicos, que lhes causam doenças. Entre os microrganismos endofíticos, os fungos e bactérias que formam os nódulos nas raízes das plantas às quais estão associados, são bastante estudados devido a sua importância na agricultura, particularmente por sua participação na fixação de nitrogênio atmosférico (micorrizas diazotóficas de rizosfera). Ao contrário, os endofiticos das partes aéreas dos vegetais só recentemente têm despertado o interesse da comunidade científica, especialmente por seus potenciais na produção de metabólitos de interesse biotecnológico [2-5].

Apesar de devidamente compreendida a existência da microbiota endofítica, muitas pesquisas ainda devem ser feitas a respeito dos aspectos ecológicos, genéticos e fisiológicos desta interação. Além disto, é interessante conhecer a diversidade destes organismos, sua presença, frequência e funções. Existe uma série de razões para aprofundar os estudos dos endofíticos como a falta de informação para elucidar a base biológica dessas interações e as vantagens às plantas já atribuídas à presença deles [6].

Embora as interações endofítico-planta, ainda não sejam muito bem compreendidas, sabe-se que podem ser simbióticas, neutras ou antagônicas. Nas interações simbióticas, os microrganismos produzem ou induzem a produção de metabólitos primários e secundários que podem conferir diversas vantagens à planta tais como a diminuição da herbívora e do ataque de insetos, o aumento de tolerância a estresse abiótico e o controle de outros microrganismos. Exemplos de metabólicos que podem ser induzidos pelos endofíticos são as fitoalexinas, substâncias de baixo peso molecular com atividades antimicrobianas produzidas pelas plantas ante a ação de microrganismos ou agentes estressantes, micotoxinas e outros metabólitos secundários produzidos por fungos que podem causar doenças em humanos e outros animais, e/ou, apresentar propriedades antimicrobianas, antioxidantes e antihipertensivos. Novos antibióticos, antimicóticos como cryptocardina, imunossupressores e antineoplásicos como o taxol, poderoso antitumoral, são alguns exemplos de metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos de extrema relevância na indústria farmacêutica [7-17].

Além da importância descrita para a indústria farmacêutica, os microrganismos endofíticos são valiosas ferramentas como vetores para introduzir genes de interesse em plantas visando á produção de inibidores de pragas e patogênicos [18-21].

Agricultura orgânica ou agricultura biológica é o termo frequentemente usado para designar a produção de hortaliças e outros produtos vegetais sem uso de produtos químicos sintéticos, tais como fertilizantes inorgânicos (nitratos, fosfatos, etc) e pesticidas, nem organismos genéticamente modificados. Este sistema de produção, que exclui o uso de fertilizantes, agrotóxicos e produtos reguladores de crescimento, tem como base o uso de estercos animais, compostagem e controle biológico de pragas e doenças. Mas, é justamente na fertilização com estercos, que se não tratados adequadamente antes do emprego (e é sabido que são usadas até fezes de porco e fezes humanas na adubação de solos) que resulta numa alta fonte de contaminação microbiana.

O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presença de bactérias Gram negativas potencialmente patogênicas em pés de hortaliças oriundas de cultivos orgânicos (alfaces lisa e crespa, acelga, manjericão, espinafre, coentro e couve) adquiridas em supermercados da região de Higienópolis da cidade de São Paulo.

Material e métodos

Esterilização do material coletado: O material coletado foi processado no prazo de 24 horas, após a coleta, lavando-o abundantemente com água corrente e detergente neutro. Em seguida, em câmera asséptica, o material foi imerso em álcool etílico 70% (v/v) por 1 minuto, a seguir, em hipoclorito de sódio 3% (v/v) por 4 minutos e novamente em álcool etílico 70% por 30 segundos para retirar o excesso de hipoclorito, e finalmente, enxaguou-se com água destilada estéril 3 vezes para retirar qualquer resíduo.

Isolamento de endofíticos: Após a assepsia, pequenos fragmentos de folhas e caules de aproximadamente 1 cm2 cortados com tesoura esterilizada, foram colocados em placas de Petri contendo meio de cultivo LB (Luria- Bertani) de composição: extrato de levedura 0,5%, triptona 1,0%, cloreto de sódio 1% e agar 1,5%. As placas com os fragmentos foram incubadas a 25-30 °C por uma semana.

Identificação de bactérias: Os testes bioquímicos realizados foram: fermentação de lactose, produção de gás, produção de gás sulfídrico, produção de uréase, produção de L-triptofanodesaminase, produção de lisina descarboxilase, produção de indol, motilidade, utilização de citrato como fonte de carbono e presença de citocromo-oxidase. Os resultados foram interpretados de acordo com as instruções do fabricante (enterokit Probac® Brasil) e de acordo com “Koneman, diagnóstico microbiológico, 2006” [22] e “Bergey´s Mannual of Systematic Bacteriology, 2005” [23].

Foram escolhidas aleatoriamente várias colônias isoladas de bactérias desenvolvidas ao redor dos fragmentos de folhas e caules e transferidas (cultivo por esgotamento) para placas contendo meio seletivo McConkey. Depois de incubadas por 24-48 horas, foram transferidas colônias isoladas fermentadoras de lactose (de cor vermelha) e colônias não fermentadoras de lactose (colônias esbranquiçadas) para provas bioquímicas (reações fornecidas pelo “Enterokit” Probac ® Brasil) e mais teste complementar, como prova de presença da enzima citocromo oxidase para aquelas bactérias suspeitas de serem Pseudomonas e/ou Acinetobacter.

Resultados

Foram analisadas qualitativamente diferentes hortaliças provindas de cultivos orgânicos adquiridas em supermercado da região de Higienópolis, cidade de São Paulo: Alface (Lactuca sativa, família Astaraceae); manjericão (Ocimum gratissimum L., familia Lamiaceae); acelga (Beta vulgaris var. cicla (L) K, Koch, família Amaranthaceae); espinafre (Spinacia oleraceae, família Amaranthaceae); couve (Brassica oleraceae, família Brassicaceae) e coentro (Coriandrum sativum L., família Apiaceae).

Da alface, foram analisados dois pés de alface crespa, um pé de alface lisa e um pé de alface roxa crespa. Das demais hortaliças, só um pé. De todas, tomaram-se três folhas ao acaso para fazer as análises. Foram identificadas 46 colônias bacterianas Gram negativas, das quais 27 (58,7%) resultaram pertencentes às enterobactérias, 14 (30,4%) ao gênero Acinetobacter e 5 (10,9%) ao gênero Pseudomonas (Tabela 1).

Discussão

São microrganismos endofíticos (bactérias e fungos) aqueles que habitam em pelo menos um período de seu ciclo de vida tecidos vegetais sadios podendo permanecer latentes ou colonizando ativamente tecidos de forma localizada ou sistêmica, exercendo diversas atividades benéficas para a planta hospedeira assim como fixação de nitrogênio, produção de metabólitos biologicamente ativos como antibacterianos e antifúngicos, fatores de crescimento etc. Contudo, muitas espécies bacterianas endofíticas são patogênicas ou potencialmente patogênicas para o homem [2].

A agricultura orgânica ou agricultura biológica exclui o uso de produtos químicos sintéticos, tais como fertilizantes inorgânicos (nitratos, fosfatos, etc) pesticidas, e organismos genéticamente modificados, mas tem como base o uso de estercos animais, compostagem e controle biológico de pragas e doenças. Mas, é justamente na fertilização com estercos, que se não tratados adequadamente antes do emprego que resulta numa alta fonte de contaminação microbiana.

A utilização de excretas é motivada pelo reconhecimento de seu valioso conteúdo de nutrientes para as plantas. É sabido que são utilizados estercos de porco e fezes humanas como adubos de hortaliças. A excreta humana pode conter também microrganismos patógenos, que diretamente ameaça a saúde humana. A diarreia e as doenças parasitárias são fatores importantes que contribuem com a Carga Mundial de Doenças onde os maiores causadores são a transmissão ambiental através da água e dos cultivos alimentícios contaminados, ou mediante o contato direto com as fontes contaminadas por matéria fecal. As excretas usualmente não contêm contaminantes químicos industrializados, mas devem ser tratados para reduzir os níveis de patógenos em níveis de segurança. Metabolitos humanos como os hormônios podem também existir, mas o reuso em terras cultiváveis diminuiria o impacto negativo assim como nas fontes de água [24].

Um sistema para o controle e gestão da exposição microbiana no que diz respeito ao uso de águas residuárias e excretas foi elaborado e publicado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) na década de oitenta [25] e revisado posteriormente [26]. Nesse relatório enfocou-se o tratamento e manejo das fezes e da urina, levando em conta informação atual da gestão de riscos e limitando a uma estratégia de separação na fonte.

A presença dos organismos causadores de doenças na excreta humana é o resultado da infecção dos indivíduos. Este tipo de infecção não se manifesta necessariamente com sintomas clínicos (portadores assintomáticos) mas podem conduzir a uma excreção dos patógenos em questão. Para os organismos que infectam o trato gastrointestinal, esta contaminação se dá basicamente através das fezes.

A prevalência e a incidência de infecções é um espelho da situação de higiene da sociedade. As infecções são sempre uma exceção e não um estado comum do indivíduo. As infecções podem ser crônicas para doenças bacterianas e virais. Nestes casos os indivíduos são chamados de “portadores”. Parasitas como vermes (helmintos) podem estabelecer-se por períodos prolongados de tempo no corpo humano e têm uma taxa alta de prevalência na sociedade com condições insalubres.

Uma pessoa normalmente excreta grandes quantidades de microrganismos na matéria fecal. Os números estão na faixa de 10¹¹-10¹³/g. Estes organismos saprófitos geralmente não são motivo de preocupação para a saúde. A urina é normalmente estéril na bexiga, mas pode carregar organismos que se encontram nas partes baixas do trato urinário. Assim, um conteúdo de 103 organismos/mL na urina não é um indicativo de infecção. Os organismos saprófitos são normalmente inofensivos. Se um organismo causador de doença infecta uma pessoa, as manifestações clínicas são governadas por fatores relacionados ao organismo da pessoa em questão. A maioria dos organismos causadores de doenças relacionadas a saúde pública é excretada nas fezes, em uma quantidade variável, mas poucos deles através da urina. A probabilidade de que eles infectem novos indivíduos está em função do contato e da exposição. Esta, por sua vez, é regida por fatores como as quantidades excretadas e da dose infecciosa (número de organismos que deve ser ingerido de maneira oral para causar uma infecção), que varia entre os diferentes organismos e até mesmo entre as linhagens. Poucos tipos de organismos podem infectar através da pele. A probabilidade de contato e exposição está relacionada à capacidade das diferentes espécies e cepas de tolerar condições ambientais adversas fora do corpo humano e persistir no estágio no qual podem infectar um novo individuo exposto [24].

Neste trabalho foram identificados vários gêneros bacterianos de relevância clínica tais como os pertencentes às enterobactérias: Klebsiella, Serratia, Hafnia, Yersinia, Shigella, Salmonella, Edwarsiella, Proteus, Escherichia, e o não fermentadores: Acinetobacter e Pseudomonas.

Conclusões

Todos os microrganismos identificados no presente trabalho ocupam o mesmo nicho ecológico, como água, solo, plantas, trato intestinal de animais de sangue quente etc. podendo desencadear doenças como infecções do trato urinário e gastroenterites, sendo que se não tratadas rapidamente e de forma efetiva podem levar a quadros graves e até a morte.

Mesmo depois de passar por um minucioso processo de desinfecção as hortaliças orgânicas analisadas apresentaram potencial patogênico para os consumidores, uma vez que se o indivíduo estiver com o sistema imunológico prejudicado, ao ingerir este tipo de hortaliça, pode desenvolver alguma das doenças supracitadas.

As pessoas geralmente adquirem produtos orgânicos pelo fato dos mesmos serem rotulados como mais saudáveis, por não possuírem agrotóxicos e pesticidas. Mas, a utilização de adubo natural, composto por restos de alimentos e dejetos de animais é passível de contaminação bacteriana. Todas as plantas possuem microrganismos endofíticos que podem ser simbióticos ou comensais; porem, poucos estudos foram realizados com relação à interação desses organismos endofíticos com os consumidores diretos das plantas hospedeiras. Logo, se faz necessário realizar estudos buscando estabelecer a relação entre consumo deste tipo de alimentos (hortaliças orgânicas) e surtos, uma vez

que se demonstrou nesse trabalho a existência de bactérias potencialmente patogênicas para os seres humanos.

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