Citocinas reguladoras (IL-10 y TGF-β) en pacientes con leishmaniasis cutánea Americana

Palabras clave: IL-10, TGF-β, leishmaniasis cutáea Americana.

Key words: IL-10, TGF-β, American cutaneous leishmaniasis

INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis cutánea Americana (LCA) es producida por la infección con protozoarios del género Leishmania. La misma presenta un espectro de formas clínicas que poseen entre sí características distintivas bien establecidas (Convit, 1974; Convit et al., 1993). En un extremo del espectro se sitúa la forma inmunocompetente (leishmaniasis cutánea localizada, LCL), con un patrón de respuesta CD4+ Th1, en el cual se producen niveles adecuados de interferón-g (IFN-γ), linfotoxina (Lt), factor de necrosis tumoral -a (TNF-a) e interleucina-2 (IL-2) que conducen a la eliminación efectiva de los parásitos (Cáceres-Dittmar et al. 1993, Castés et al. 1996). Al otro extremo del espectro, se ubica la forma anérgica leishmaniasis cutánea difusa, (LCD); en donde el patrón de respuesta que se establece es de tipo Th2, predominando la producción de IL-4, IL-5, IL-10 y IL-13 entre otras citocinas, que conducen a la inhibición de los mecanismos leishmanicidas en los macrófagos y en consecuencia el parásito se disemina (Cáceres-Dittmar et al., 1993, Bomfim et al., 1996, Castés et al., 1996). Entre estas formas polares hay manifestaciones intermedias en las cuales se ubica la leishmaniasis mucocutánea (LCM) y la leishmaniasis cutánea intermedia (LCI), en esta última no hay compromiso mucoso y las lesiones pueden ser simples o múltiples, de desarrollo atípico, placas o múltiples úlceras (Zerpa et al., 1999, Díaz et al. 2002). De estas formas intermedias, la LCM ha sido la más estudiada, en estos pacientes se evidencia una elevada producción de IFN-g, TNF-a y óxido nítrico (Castés et al., 1988, 1993; Cabrera et al., 2003), y una baja carga parasitaria, lo cual ha permitido sugerir que el daño tisular que presentan estos pacientes es mediado por la exacerbada respuesta inflamatoria que se desarrolla. Esto, puede ser reflejo de un defecto en los mecanismos de regulación de la respuesta inmune. En ese sentido, la IL-10 y el TGF-β son reconocidas citocinas moduladoras de la respuesta inmune; en leishmaniasis las células recién infectadas, y las células T reguladoras CD4+CD25+ FoxP3+, liberan estas citocinas, modulando la respuesta hacia un patrón Th2, lo que inhibe: activación de los macrófagos, la presentació antigéica, , la expansió / proliferació clonal de los linfocitos T y la liberación de citocinas pro-inflamatorias (Barral et al.,1995; Rocha et al., 1999; Shevach, 2002). Muchos de estos reportes en humanos, son derivados de estudios aislados con alguna u otra de las formas clínicas que componen el espectro de la LCA, generádose en algunos casos, resultados contrastantes. Hasta la fecha no existe un estudio en el cual se documente la variación de estas citocinas en forma simultáea en las manifestaciones polares del espectro así como en la LCM y LCI.

En el presente trabajo nos propusimos evaluar las variaciones de IL-10 y el TGF-β en pacientes con LCA, a fin de establecer si existen alteraciones en la producción de estas citocinas en las diferentes formas clínicas de la enfermedad.

Pacientes: El estudio comprendióun total de 66 pacientes con LCA con un promedio de 31,83 ± 18,64 años de edad, los cuales fueron evaluados en la sección clínica de leishmaniasis del Instituto de Biomedicina, Caracas, Venezuela. Se incluyeron los siguientes grupos de pacientes: LCL (n=20), LCI (n=20), LCM (n=14) y LCD (n=12). Ellos fueron diagnosticados siguiendo criterios clínicos, epidemiológicos e histopatológicos establecidos por Convit (1974). Los pacientes con LCL tenían una evolución de la enfermedad de menos de 4 meses. Ninguno de los pacientes se encontraba bajo algú tipo de tratamiento al momento de realizar el estudio. Todos los pacientes o los representantes legales de los menores de edad aceptaron voluntariamente su participación en el estudio.

Individuos voluntarios sanos: Un total de 22 individuos sanos fue estudiado (edad promedio: 33,72 ± 18,13 años). Todos provenian de diferentes zonas endémicas de nuestro país y eran negativos a la prueba de Montenegro o leishmanina.

En este estudio se utilizó un antígeno crudo de Leishmania (V) braziliensis (cepa MHOM/BR/75/M2903). Los promastigotes en la fase estacionaria de crecimiento fueron autoclavados y almacenados a 4ºC.

Las células mononucleares de sangre periféica (PBMC), fueron aisladas de 20 mL de sangre venosa heparinizada de pacientes con LCA y sujetos controles. El aislamiento y el cultivo in vitro de las PBMC de los diferentes grupos se realizósegú lo descrito en un estudio previo (Cabrera et al., 2000). Las células fueron dispensadas por triplicado para cada condició experimental, en placas fondo plano estéiles de 96 pozos a una concentració de 2 x 10⁵ céulas/pozo y se estimularon con antíeno crudo de Leishmania (V) braziliensis (L.b.) (2 x 10⁵ paráitos/pozo) o solo medio RPMI 1640 (Gibco, USA). Las placas fueron incubadas a 37º 5% CO_2. Después de 6 dís, se colectaron 100 μL/pozo de sobrenadante y se almacenóa -70º para posterior evaluació de citocinas.

La concentració de TGF-β en el plasma y en los sobrenadantes de los cultivos celulares estimulados con L.b., fue determinada mediante el uso de una ELISA de captura comercial, siguiendo las recomendaciones del fabricante (TGF-β Duoset, R&D Systems, USA). La concentració de TGF-β fue determinada mediante una curva patró realizada con TGF-β recombinante suministrado por el kit (0 a 2000 pg/mL) por lo que los resultados fueron expresados en pg/mL. Para los sobrenadantes se sustrajo la concentració de TGF-β determinada en los pozos controles sin estimulación de los estimulados.

En la Tabla I se presenta la concentración de IL-10 y TGF-βestimada para los distintos grupos de pacientes con LCA e individuos voluntarios sanos en muestras de plasma. Se evidenció un incremento significativo en la concentración de TGF-βentre los diferentes grupos de pacientes respecto a los controles (0.0001<P<0.001 por el test de Mann Whitney). Siendo más elevados en los pacientes con LCM respecto a los LCL y LCI. En contraste, no se observaron variaciones significativas entre los grupos en la concentración de IL-10.

Como puede evidenciarse en la Fig. 1, en todos los grupos de pacientes se encontró un porcentaje significativo de respondedores por TGF-β asociados con OR significativos: LCL: OR=8.073; LCI: OR=9,9; LCM: OR=87 LCD: OR=19,12.

Por otra parte, los estudios previos en citocinas reguladoras (TGF-β y la IL-10) no se han realizado simultáneamente en todas las formas clínicas que comprende el espectro de la LCA, y algunos de ellos proporcionan información contrastante por lo cual decidimos evaluar las variaciones de estas citocinas a lo largo de las distintas manifestaciones clínicas del espectro de la LCA para tratar de dilucidar su papel en esta enfermedad.

En ese sentido, se conoce que la IL-10 es una de las citocinas más importantes en modular la respuesta inmune en pacientes con infecciones crónicas incluyendo leishmaniasis (Rocha et al., 1999); principalmente por su capacidad en inhibir la síntesis de IFN-γ y por ende la activació de los macróagos. Diferentes estudios han demostrado que la IL-10 es capaz de inhibir la respuesta inmunológica de tipo Th1 y Th2 tanto en modelos experimentales como en enfermedades infecciosas en humanos. Previos estudios han evidenciado que la inhabilidad en producir IFN-γ observada en los pacientes con leishmaniasis visceral en su fase aguda y en los pacientes con leishmaniasis cutáea en la fase inicial de la infecció, puede ser restaurada al neutralizar la IL-10 mediante el uso de anticuerpos monoclonales contra la misma (Carvalho et al., 1994; Rocha et al., 1999; Bourreau et al., 2009). Otro estudio mostróque la adició de IL-10 recombinante a cultivos celulares de pacientes con leishmaniasis visceral curados, suprime la respuesta de los linfocitos T (Bacellar et al., 2000).

En el presente estudio, estimamos esta citocina mediante el méodo de CBA Array (BD Biosciences), el cual ha sido utilizado satisfactoriamente en otras investigaciones, utilizando muestras de suero de pacientes con Kala azar, PKDL (Ansari et al., 2006) y malaria (Lyke et al., 2004). En nuestro estudio no detectamos variació en la concentració plasmáica de la IL-10 entre los diferentes grupos de pacientes y los individuos controles. Sin embargo, luego de estimulación con el antígeno de L. braziliensis, las PBMC de los pacientes con LCI mostraron una baja producción de IL-10 comparado con la respuesta desarrollada por los pacientes con LCM y LCD. Si bien, se ha encontrado en las lesiones de pacientes LCM un predominio de ARN mensajeros para la IL-10 (Cáeres-Dittmar et al., 1993; Pirmez et al.,1993), lo cual apoya nuestras observaciones, existen reportes contrarios (Bacellar et al., 2002; Díz et al., 2002; Díz et al., 2006). Bacellar et al. (2002), evidenciaron una disminución en la producción de esta citocina en los pacientes con LCM respecto a los LCL. Similarmente, luego de la curación clínica de pacientes con LCM se ha demostrado que la producción in vitro de esta citocina sigue siendo menor en los pacientes mucocutáeos que en los LCL (Góez-Silva et al., 2007). Otros investigadores observaron un mayor porcentaje de células positivas para IL-10 en las lesiones de los pacientes con LCI respecto a las lesiones de los sujetos con LCL; este estudio no incluyópacientes LCM (Díz et al., 2002, 2006). Por otra parte, otra investigació sugiere que el defecto en la regulación de la respuesta inflamatoria exacerbada caracterítica de los pacientes con LCM no es a nivel de una defectuosa producción de IL-10 sino en sus receptores; ellos no encontraron diferencias en el porcentaje de células positivas para la IL-10 en los pacientes con LCM respecto a los LCL, pero demuestran la disminució de la expresió del receptor para esta citocina en los primeros (Faria et al., 2005).

Contrario a lo reportado por Castellano et al. (2009), los pacientes con LCL evaluados en nuestro estudio, no mostraron una producción importante de IL-10 en ninguna de las condiciones en que fue evaluada ("in vivo" e "in vitro"). Éto podrí ser consecuencia de la migració de las céulas T reguladoras (principales fuentes de IL-10 y TGF-β) desde la periferia hacia las lesiones, puesto que se ha reportado que estas células y los transcriptos de Foxp3+ son abundantes en las lesiones de estos pacientes (Campanelli et al., 2006; Bourreau et al., 2009). Má aú se ha especulado que estas células pudiesen estar regulando a las células efectoras en el sitio de la lesión.

El TGF-β es otra citocina importante en la modulación de la respuesta inmune en leishmaniasis experimental (Barral-Netto et al., 1992; Barral et al., 1993). Por una parte se ha señlado que la producció de TGF-β es inducida por el paráito y constituye un mecanismo de evasión de la respuesta inmunológica del hospedador al suprimir a los linfocitos T CD4+ Th1 (Barral-Netto et al., 1996). Recientemente se ha develado como una molécula importante en la iniciación de la respuesta inflamatoria y en la diferenciació de las céulas T CD4+ Th17 (Wahl, 2007).

En el presente estudio, encontramos que la concentració plasmáica de TGF-β estuvo incrementada significativamente en todos los grupos de pacientes con LCA (LCL, LCI, LCM y LCD) respecto a los controles, asociados con OR significativos. Sin embargo, la asociació má fuerte fue con los pacientes con LCM (OR=87). Esto concuerda con estudios previos, en los cuales macrófagos aislados de pacientes con leishmaniasis cutáea producen TGF-β al infectarlos con L. amazonensis, L. donovani o L. braziliensis (Barral-Netto et al.1996). En las lesiones de los pacientes con LCA se ha encontrado un número variable de parásitos estando muy incrementados en la forma difusa de la enfermedad, lo cual podría explicar en parte la alta producción de TGF-β. No lo es así para los pacientes con LCM, cuyas lesiones aL.b.ergan un escaso número de parásitos (Convit et al., 1993). Sin embargo estos mostraron una mayor concentración de TGF-β en plasma comparado con los pacientes LCI, LCL y en los sobrenadantes comparado nuevamente con los LCI y LCD. Otros estudios, también han reportado la presencia de TGF-β en las lesiones de pacientes con LCL, LCI y LCM (Barral-Netto et al., 1996; Díaz et al., 2006).

Notoriamente, las PBMC de los pacientes con LCI mostraron una disminución o ausencia en la producción de citocinas reguladoras (TGF-β e IL-10) luego de estimulación con L. braziliensis. Todo esto indica que la poca o ausente producción de estas citocinas no es suficiente para regular la respuesta inmunológica que se establece en estos pacientes y la misma se hace crónica.

En conclusión, las citocinas reguladoras (IL-10 y TGF-β) pareciesen tener un significado distinto a lo largo del espectro de la LCA. El hallazgo más interesante de este estudio fue que en el área intermedia del espectro, la respuesta esta citocinas fue diferente. Los pacientes con LCI mostraron disminución o ausencia de ambas citocinas lo cual podría relacionarse con la cronicidad de la enfermedad que experimentan estos pacientes. En contraste, los pacientes con LCM, mostraron respuestas significativas de ambas citocinas, lo cual no se traduce en regulación o modulación de la respuesta inflamatoria que se evidencia en estos pacientes. Esto, nos hace especular que quizás sean otros factores los implicados en esta respuesta inflamatoria incontrolada. Para dilucidar esto, es necesaria la realización de futuras investigaciones orientadas en la determinación de factores recientemente vinculados con la génesis de enfermedades inflamatorias crónicas y relacionadas con el TGF-β. La determinación de citocinas IL-17, IL-9 e IL-22, asociadas con las subpoblaciones de linfocitos T recientemente descritas: Th17, Th9 y Th22 (Annunziato et al., 2007; Annunziato & Romagnani 2009; Eyerich et al., 2009; Vedlhoen et al., 2008) constituyen buenos candidatos para este propósito.

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