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Boletín de Malariología y Salud Ambiental

versión impresa ISSN 1690-4648

Bol Mal Salud Amb vol.54 no.1 Maracay jun. 2014

 

La transfección del gen de ATPasa (tipo vacuolar) de Leishmania mexicana incrementa la virulencia en aislado no virulento de Leishmania enriettii

Transfection of the ATPase gene (vacuolar type) from Leishmania mexicana enhances virulence in a non-virulent strain of Leishmania enriettii

Alexis Fernández1 & Noris Rodríguez2*

1 Laboratorio de Ingeniería Genética, Servicio Autónomo Instituto de Biomedicina, Ministerio del Poder Popular para la Salud. San Nicolás a Providencia, San José, Caracas. Venezuela.

2 Laboratorio de Ingeniería Genética, Instituto de Biomedicina, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. San Nicolás a Providencia, San José, Caracas. Venezuela.

*Autor de correspondencia: nmrodric@gmail.com

RESUMEN

En este trabajo se muestran los resultados obtenidos, después de la transfección en Leishmania (L.) enriettii del gen de ATPasa del tipo vacuolar extraído de Leishmania (L.) mexicana. Los promastigotes transfectados fueron evaluados In vitro, utilizando líneas de macrófagos e In vivo, utilizando dos modelos experimentales (Ratones Balb/c y Hámsteres dorados). El progreso de la infección fue registrado semanalmente por las mediciones realizadas en el sitio de inoculación. Se colectaron muestras de piel, ganglio poplíteo, hígado, bazo, corazón y sangre para realizar el diagnóstico parasitológico; utilizando histopatología y reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Los grupos inoculados con L. enriettii transfectadas presentaron diferencias significativas en el tamaño de la lesión respecto al grupo control sin transfección. La PCR fue positiva en piel y ganglios linfáticos las primeras semanas y posteriormente en bazo, hígado, corazón y sangre, lo cual pone en evidencia la migración de los parásitos a otros órganos. En los grupos control los parásitos fueron detectados solamente en el lugar de inoculación y no en otros tejidos. Los resultados demuestran el papel del gen ATPasa del tipo vacuolar en los procesos de invasión de Leishmania a la célula huésped y el incremento de la virulencia de L. enriettii después de la transfección del mencionado gen en estos parásitos.

Palabras clave: Virulencia, Leishmania, ATPasa vacuolar

SUMMARY

In this study we examined the effect of the transfection of the vacuolar type ATPase gene from Leishmania (L.) mexicana to Leishmania (L.) enriettii. Transfected promastigotes were evaluated in vitro using macrophages and in vivo using two experimental models (Balb/c mice and Golden Hamsters). The progression of the infection was recorded weekly by measurements taken at the inoculation site. Samples of skin, the popliteal ganglion, liver, spleen, heart and blood were taken for parasitological diagnosis: histopathology and the polymerase chain reaction (PCR). The groups inoculated with transfected L. enriettii showed significant differences in the size of the lesions with respect to the control group (without transfection). The PCR analysis showed positive for L. enriettii in the skin and lymph nodes during the first weeks post-infection and subsequently in the spleen, liver and heart, thus suggesting that the parasites migrate between organs. In the control group, parasites were detected in the skin at the inoculation site but not in the other organs tested. The results demonstrate the role the vacuolar ATPase gene plays in the invasion of the host cells by Leishmania, and the increase in the virulence of L. enriettii after transfection with this gene

Key words: Virulence, Leishmania, vacuolar ATPase.

Recibido el 20/12/2013

Aceptado el 23/06/2014

INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis es causada por diferentes especies de protozoarios pertenecientes al género Leishmania (Matlashewski, 2001; WHO, 2014). En el humano estos parásitos generan un amplio espectro de manifestaciones clínicas, las cuales se han asociado tanto a la especie de Leishmania que causa la infección, como a la respuesta inmunológica del hospedero vertebrado (Convit & Pinardi, 1972; Convit & Pinardi, 1974; Rondón, 1993). En Venezuela, ésta enfermedad está ampliamente distribuida en todos los estados, siendo el Estado Nueva Esparta una zona endémica para la forma visceral de la enfermedad, y no se reportan casos de leishmaniasis cutánea (LC) (Zerpa, 2002). En nuestro país la LC esta asociada a dos especies del parásito, siendo la mas predominante L. braziliensis con respecto a L. mexicana (Rodríguez et al., 2001). En general, Leishmania tiene un espectro que va de poco virulento a muy virulento. La virulencia está definida como el grado de patogenicidad de un microorganismo lo cual se refleja en el espectro de signos y síntomas clínicos observados en las enfermedades humanas (Chang, 1990; Chang & Mc Gwire, 2002). La virulencia en Leishmania puede estar modulada por factores ambientales y genéticos, además de sus hospedadores mamíferos (Blackwell, 1996) y de los insectos vectores (Titus & Ribeiro, 1998). En Leishmania muchos investigadores definen "genes de virulencia", como aquellos importantes en la supervivencia y/o patogenicidad del parásito dentro del insecto vector o en el hospedador mamífero pero que no afectan el crecimiento de los parásitos en medios de cultivo (Beverly, 2002). Es evidente que Leishmania posee moléculas relacionadas con la infección (determinantes invasivos/evasivos), los cuales permiten el establecimiento de los parásitos intracelularmente, en los fagolisosomas o vacuolas parasitófagas del macrófago (Chang & Dwyer, 1976). Estos determinantes en su mayoría están incluidos en la literatura como "factores de virulencia". Todas estas moléculas al parecer juegan un papel importante en la infección de los macrófagos por Leishmania, dentro de las cuales se pueden citar: Lipofosfoglicanos, Cistein proteasas, Glicosil fosfatidilinositol, Glicosilfosfolipidos, Fosfoglicanos, Proteofosfoglicanos, Glicoproteinas, Histonas y ATPasas (Guy & Belosevic, 1993; Spath et al., 2000; Rodríguez et al., 2002; Spath et al., 2003; Mottram et al., 2004). Todas ellas ayudan a Leishmania a establecerse exitosamente en el interior del macrófago, de esta manera la respuesta al proceso mediante el cual, el parásito Leishmania produce la leishmaniasis es compleja y en ella están involucrados múltiples factores asociados con el parásito y la célula huésped (Rodríguez, 2003). En los últimos años, con los grandes avances en biología molecular, en especial la tecnología de ADN recombinante y transfección genética se ha podido demostrar la participación de otros genes en los procesos de virulencia en Leishmania, como son los genes que codifican para la proteína fosfomanosa isomerasa (Garami e Ilg, 2001), disulfito isomerasa (Ben Achour et al., 2002) y los genes relacionados con Ca2+ATPasa (Lu et al., 1997; Rodríguez et al., 2002). El Ca2+ es de suma importancia en los procesos de invasión de los parásitos intracelulares, y su concentración citosólica es dependiente de transportadores como lo son las Ca2+ATPasas existentes en la membrana plasmática, retículo endoplasmático y acidocalcisomas (Carafoli & Brini, 2000; Moreno & Docampo, 2003). La participación de la Ca2+ATPasa del retículo endoplasmático en los procesos de virulencia fue puesta en evidencia, luego de la transfección del gen Lmaa1 en cepas de L. mexicana y L. braziliensis, observándose un incremento de la virulencia en los parásitos relacionados directamente con una sobre expresión de esta proteína. Los estudios apuntan hacia la búsqueda de diferencias entre las Ca2+ATPasas en diferentes especies de la familia Trypanosomatidae, con respecto a la estructura homóloga de mamíferos, con el objeto de establecer diferencias relevantes desde el punto de vista terapéutico, en el desarrollo de drogas contra las enfermedades causadas por estos parásitos (Benaim, 2004).

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis de secuencias y transfección genética

Se diseñaron secuencias iniciadoras ("primers") a partir de secuencias específicas para ATPasas del tipo vacuolar reportadas en el banco de genes (XM_001682262.1). V1 (5´-TCCAATTTCGCCGGAGAG-3´) y V2 (5´-CATCAAGGCTGAGACGAG A-3´). La RT-PCR se realizó con los "primers" diseñados y se utilizó como blanco ARN de L. mexicana (MHOM/BZ/82/BEL21). Se seleccionó el producto de mayor homología al ser hibridado con la sonda LmaVac (Fernández & Rodríguez, 2005). El ADN de interés fue enviado al Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CESAAN) en el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

La secuencia seleccionada fue clonada en el vector P2.2 NEO el cual confiere resistencia al aminoglucósido geniticina G418 (Promega) y transfectada por electroporación (Gene pulser II, Biorad) en promastigotes de Leishmania (L) enriettii (MCAV/BR/45/L88).

Se infectaron macrófagos de la línea J774-G8 en una relación de 1:10 con promastigotes transfectados (LeT) y sin transfectar (Le). Se evaluó el proceso de unión de los parásitos a los macrófagos a diferentes tiempos, 2, 4, 6, 24, 48 y 72 horas. Para la observación al microscopio, las células fueron fijadas y teñidas con el reactivo de Giemsa. Se contaron 15 campos en cada experimento por cuadriplicado.

Ensayos en animales experimentales

Previa aprobación del Comité de Bioética del Instituto de Biomedicina, se procedió a los estudios en animales experimentales en el Bioterio del Instituto. Se utilizaron 80 ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad y 40 hámsteres dorados hembras. Los ratones se dividieron en 8 grupos de 10 ratones cada grupo. 4 grupos de ratones fueron inoculados en la almohadilla plantar con 1x106 promastigotes transfectados (LeT) y 4 grupos fueron inoculados con 1x106 promastigotes no transfectados (Le). El tamaño de la lesión se determinó semanalmente solamente en el modelo murino, se utilizó como control de la infección la pata colateral no infectada. Los hámsteres fueron divididos en cuatro grupos. Dos grupos fueron inoculados en la almohadilla plantar con 1x106 LeT y dos grupos con 1x106 Le. No se tomaron medidas del tamaño de lesión en estos grupos experimentales, ya que este modelo fue utilizado sólo para evaluar la presencia de parásitos en distintos órganos. Después de la infección se sacrificaron semanalmente hasta la decima semana, 4 ratones y 2 hámsteres de cada grupo y se tomaron muestras para histopatología, cultivo en medios artificiales y PCR para el diagnóstico parasitológico, utilizando primers universales para la detección de Leishmania sp 13A (5´-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3´) y 13B (5´-ATTTTACACCAACCCCCAGTT-3´) (Rodgers et al., 1990)

Consideraciones éticas

Los animales experimentales fueron tratados bajo las normas y principios de la guía internacional para la investigación biomédica que involucra animales (Bankowski Z. & Howard-Jones N., 1986); así mismo se solicitó la correspondiente autorización del Comité de Bioética del Instituto de Biomedicina.

RESULTADOS

El análisis de la secuencia seleccionada presentó 95% de homología con ATPasa vacuolar del tipo P de Leishmania mexicana (Fig. 1). Así mismo se pudo comprobar la eficiencia del método utilizado para la transfección del gen a los parásitos. La presencia del gen fue evidenciada mediante la hibridación de los productos de digestión del ADN genómico obtenido de los promastigotes transfectados con la enzima BamH1, utilizando la sonda LmaVac32P (Fig. 2A). En la Fig. 2B se observa la alta homología entre la sonda utilizada y un fragmento de 3,5 Kb que está presente en la cepa de referencia (Bel 21) carril 1 y también se observa en la cepa transfectada (LeT) en el carril 2. Adicionalmente se observó una alta homología al hibridar el ARN mensajero con la sonda Lmavac32P con un transcripto de aproximadamente 1,2 Kb (resultado no mostrado). Al evaluar la función biológica del gen transfectado in vitro, se pudo observar, después de dos horas de interacción de los parásitos transfectados (LeT) con los macrófagos J774-G8; un mayor número de promastigotes unidos a la célula, con respecto al grupo inoculado con promastigotes no transfectados (Le). A las cuatro horas el grupo LeT presentó un 73,3% de unión a los macrófagos con respecto a 43,9% del grupo Le. Después de seis horas de infección se observan parásitos del grupo LeT ya fagocitados por las células, mientras en el grupo infectado con Le, no se observaron parásitos dentro de los macrófagos. Se pudo evidenciar que los parásitos transfectados incrementaron significativamente su capacidad de unión al macrófago con respecto al grupo infectado con parásitos no transfectados (Fig. 3).

Estos resultados fueron corroborados con lo obtenido en los experimentos in vivo, con ratones Balb/c, donde se observó un mayor tamaño en la lesión en el grupo de ratones inoculados con LeT con respecto al grupo inoculado con Le, en el cual no se observaron lesiones en ninguno de los animales inoculados. Las medidas obtenidas fueron analizadas para determinar la significancia estadística utilizando un análisis de varianza para medidas repetidas. El grupo LeT presentó diferencias significativas con respecto al grupo Le, siendo las lesiones producidas por LeT 10 veces mayor, 3 mm en promedio, en relación con Le, donde el promedio de las lesiones fue de 0.3 mm (P ≤ 0.05) (Fig. 4).

Se evidenció por PCR la presencia de parásitos en otros órganos a partir de la cuarta semana post infección, tal como se muestra en la Tabla I, la cual representa los resultados obtenidos para el modelo murino y de hámsteres. En la misma se observa que a partir de la primera, la PCR resulta positiva en la piel (sitio de inoculación) de ambos modelos, sin embargo en ganglio fue evidente la presencia del parasito a partir de la cuarta semana en ratones, donde también la PCR fue positiva para otros órganos como bazo e hígado a partir de la sexta semana, sin embargo para los hámsteres la presencia de los parásitos en los órganos mencionados, fue evidente a partir de la octava semana y en ganglios a partir de la quinta semana post inoculación. En la Fig. 5 podemos observar el producto amplificado de 120 pb que evidencia la presencia de ADN de Leishmania en muestras de bazo (línea 2) y ganglio (línea 4). La PCR no detectó parásitos en corazón (línea 3) ni en hígado (línea 5), tomadas en la cuarta semana. Sin embargo los estudios histopatológicos realizados a las 16 semanas post infección, demostraron la presencia de parásitos en las biopsias tomadas a los grupos infectados con LeT tanto en el modelo murino como en el modelo de hámster, observándose amastigotes en biopsias de hígado, bazo, corazón y piel (resultado no mostrado). En los grupos infectados con Le no se observaron parásitos en órganos como ganglio, bazo, hígado o corazón; solo se observó la presencia de leishmanias en el sitio de inoculación.

DISCUSIÓN

La utilización de métodos moleculares ha permitido el análisis funcional de las secuencias de interés en los parásitos protozoarios como Leishmania spp, de esta manera se han podido realizar estudios de genes en cuanto a su expresión y función dentro del parásito, así mismo se han podido identificar genes esenciales para la supervivencia, mecanismos de resistencia a drogas y de virulencia, producción de proteínas foráneas, identificación y expresión de antígenos de superficie entre otros (Cortazar & Walker, 2004). En este estudio se utilizó una cepa de L. enriettii de referencia internacional la cual es considerada de baja virulencia para mamíferos (Machado et al., 1994; Laiso, 1997), para transfectar un gen de ATPasa vacuolar aislado de L. mexicana (Bel 21), para luego evaluar la función biológica de dicho gen. Los resultados muestran que L. enriettii transfectada es mucho mas virulenta en ratones y hámsteres, generando nódulos visibles, dos semanas después de la infección experimental y desarrollando grandes nódulos a partir de la quinta semana, pero sin observarse necrosis de los mismos, lo cual si ocurre en el caso de ratones inoculados con L. (L) mexicana (cepa BEL21). Esto nos sugiere que este gen podría estar modulando la respuesta de otros factores de virulencia, lo cual podría inducir este drástico cambio en la virulencia de los parásitos. Además se pudo observar un inusual tropismo de los parásitos transfectados a diferentes órganos (hígado, bazo) de los animales experimentales, esto fortalece la teoría de la participación de las ATPasas en el proceso de infección, tal como ocurre con el gen A2, el cual es considerado un factor de virulencia que juega un papel importante en la visceralización de L. donovani (McCall & Matlashewski, 2010). El papel del gen A2 se pudo demostrar al transfectar parásitos no patogénicos a mamíferos como lo es L. tarentolae, observándose que se establece la infección en hígado y bazo de ratones BALB/c inoculados en la vena caudal (Mizbani et al., 2011). La infección por Leishmania depende de diferentes moléculas, las cuales se encuentran en la superficie del parásito o son secretadas, estas actúan como determinantes invasivos/evasivos y son expuestas al sistema inmunológico del hospedador (Chang & Mc Gwire, 2002) además de moléculas citoplasmáticas altamente conservadas las cuales son esenciales para la supervivencia del parásito y mantenimiento de la infección (Chang et al., 1999; Chang et al., 2003), estas moléculas son denominadas "patoantígenos" (Probst et al., 2001). De esta manera podríamos considerar que L. enriettii presenta una deficiencia en este tipo de moléculas y por esta razón no se establece la infección en el ratón y podríamos considerar que las ATPasas del tipo vacuolar representan factores "patoantigénicos" que estarían coadyuvando para incrementar la virulencia en Leishmania, ya que al incrementar el número de copias de este gen en el parasito transfectado, se incrementa su virulencia; mientras que en los grupos controles no se observó desarrollo de infección ni visceralización en el tiempo de experimentación. El mismo comportamiento ha sido reportado por otros autores en otra especie de Leishmania no patogénica como L. tarentolae (Breton et al., 2005). De igual manera Marchesini & Docampo en 2002, han demostrado que las protón ATPasas de L. mexicana regulan el pH intracelular durante la infección, permitiendo la supervivencia de los amastigotes y favoreciendo de esta manera la patogénesis. En otros organismos como Candida albicans también se ha demostrado la participación de las ATPasas del tipo vacuolar en la virulencia, al producir también cambios en el pH intracelular (Hayek et al., 2014). En el caso de L. enriettii, experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio no evidencian cambios en el pH intracelular. Sin embargo, la expresión de la proteína codificada por el gen LmaVac, podría estar relacionada a la virulencia expresada en L. enriettii transfectada; tal como ha sido previamente demostrado en nuestro laboratorio (Fernández & Rodríguez, 2011; Fernández & Rodríguez, 2012), Nuestro trabajo demuestra el importante papel del gen ATPasa del tipo vacuolar en los procesos de invasión de Leishmania a la célula hospedadora, observándose una mayor unión de la cepa transfectada al macrófago. Es posible que esta proteína sea el ligando de algún receptor en la célula y así se facilite la adhesión y fagocitosis, que son los pasos iniciales para la infección por Leishmania. Algunas evidencias también indican que las ATPasas podrían estar involucradas en la virulencia, debido a la acción que éstas ejercen sobre otros blancos como las proteasas de cisteína, las cuales están involucradas en estos procesos (Mottram et al., 2004). Es de suma importancia determinar cuales son los factores que están involucrados en los cambios del tropismo de los parásitos transfectados, ya que la L. enriettii no transfectada no visceraliza; este proceso también podría estar relacionado con la inhibición del proceso de necrosis, que comúnmente se observa en las lesiones en los ratones inoculados con especies virulentas, tal como ocurre en el grupo control inoculado con L. mexicana (Bel21), pero que no se observa en los ratones inoculados con la cepa transfectada.

La investigación continúa con el objetivo de determinar las bases genéticas, proteómicas e inmunológicas del fenómeno observado.

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan que no hubo conflicto de intereses con persona o institución alguna en ninguna de las etapas de ejecución de este trabajo.

AGRADECIMIENTOS

A la Sra. Marta Torrealba por su ayuda con el lavado y esterilización del material de laboratorio para la realización de los experimentos; al personal del Bioterio del Instituto de Biomedicina por su ayuda en el manejo y cuidado de los animales experimentales y al Centro de Secuenciación del IVIC por su colaboración para la secuenciación.

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