Estudio comparativo de la bioactividad de diferentes materiales cerámicos sumergidos en fluido simulado del cuerpo
Irene Barrios de Arenas 1*, Maritza Vásquez 1, Ursula Spadavecchia 2,
Sonia Camero 3, Gema González 2*
1: Lab. de Microscopía Electrónica, Dpto. de Tecnología de Materiales, Instituto Universitario de Tecnología – Región Capital, PO Box 40347, Caracas 1040. Venezuela.
2: Lab. de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Dpto. de Ingeniería, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Apartado. 21827, Caracas 1020A, Venezuela.
3: Escuela de Metalurgia y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ingeniería, Universidad Central de Venezuela (UCV). Apartado 51717, Caracas 1050, Venezuela
* E-mail: fredaren@telcel.net.ve, gemagonz@ivic.ve.
Revisado: 24-Ago-2006; Aceptado: 14-Sep-2006
Publicado On-Line el 19-Sep-2006
]]> Disponible en: www.polimeros.labb.usb.ve/RLMM/home.htmlResumen
El estudio y desarrollo de materiales para su empleo como sustitutos óseos se ha incrementado en los últimos años. Una de las características mas importantes que debe poseer el material para esta aplicación es la biocompatibilidad. Son varios los materiales que caen en este grupo, entre ellos los más destacados son las cerámicas. Estos materiales pueden reaccionar de diferentes formas, según sean sus componentes y formulaciones entre otros. La bioactividad es la capacidad que tiene el material de interactuar químicamente con los tejidos (blandos y duros) del organismo. El propósito de esta investigación es la comparación entre la bioactividad de cuatro materiales diferentes: vidrios, vitrocerámicas, hidroxiapatita porosa y corales. La investigación se llevó a cabo sumergiendo muestras de materiales estudiados en Fluido Simulado del Cuerpo (FSC), la caracterización se realizó por Microscopía Electrónica de Barrido con análisis lineal por EDX para determinar los perfiles composicionales desde el substrato hasta la superficie. Tanto los vidrios como las vitrocerámicas reaccionaron con el FSC, para formar una capa rica en Si y en algunos casos sobre esta, el depósito de una capa rica en Ca y P identificada anteriormente como apatita (CaP), reacción que indica la biocompatibilidad y bioactividad de estos materiales. La hidroxiapatita y los corales no mostraron reacción aparente con el FSC, es decir no se observó la aparición de capas superficiales.
Palabras Claves: vitrocerámicas, hidroxiapatita, corales, biocompatibilidad, FSC
Abstract
The study and development of materials as bone replacement have increased in the last years. One of the main characteristics that must have a material for these applications is the biocompatibility. There are several materials in this group, among them one of the most important are ceramics. The material’s reactions are different, depending on their components, formulations, and others. The bioactivity is the capacity of chemical interaction between the material and the body tissues (soft and hard). The purpose of this investigation is to determine the bioactivity of four different materials: glasses, glassceramics, porous hydroxyapatite and corals. This investigation was carried out using Simulated Body Fluid (SBF), the characterization was performed using Scanning Electron Microscopy and EDX line scan x-ray microanalysis to determine the compositional profiles from the substrate to the surface. The glasses as well as glass-ceramics reacted with SBF, with the development of a SiO2 rich layer, and in some cases it was observed the presence of enriched calcium and phosphorous layer identified as apatite layer (CaP), this reaction suggest the biocompatibility and bioactivity behavior of these materials. The hydroxyapatite and corals did not show apparent reaction with the SBF, the formation of a superficial layer was not observed.
Keywords: vitroceramics, hydroxyapatite, corals, biocompatibility, SBF
1. INTRODUCCIÓN
Existe una gran variedad de materiales cerámicos que pueden ser usados como implantes en el cuerpo humano, los cuales reciben el nombre de biocerámicas [1-4]. El ensayo de bioactividad es uno de los estudios que se realiza a las biocerámicas, el cual simula las condiciones del cuerpo humano, esto con el fin de determinar las posibles reacciones de la biocerámica dentro del organismo y definir si es posible su uso. Una de las características deseadas en este tipo de materiales es la bioactividad, la cual consiste en la formación de una interfaz estable con el tejido conectivo y que se igualen el comportamiento mecánico del implante con el tejido a reemplazar [5-9].
Las biocerámicas se clasifican en cuatro tipos:
]]> · Bioinertes, no promueven respuesta biológica entre el material y el hueso, ejemplos de ello son la alúmina y la zirconia· Porosas, son cerámicas con arquitectura porosa que promueven el crecimiento del tejido dentro de los poros, en la superficie o a través del implante, siendo una fijación interfacial, como ejemplo se pueden mencionar Hidroxiapatita porosa y corales transformados en Hidroxiapatita.
· Reabsorbibles o Resorbibles: están diseñados para degradarse gradualmente con el tiempo y así ser reemplazados por el tejido huésped natural, entre los más conocidos se encuentra el trifosfato de calcio y los corales.
· Bioactivas: se definen como cerámicas que "promueven una respuesta específica en la interfaz del material, lo cual resulta en la formación de un enlace químico entre los tejidos y el material", siendo los más destacados los vidrios bioactivos, la Hidroxiapatita, y las vitrocerámicas bioactivas [3,5-8].
En cuanto a los materiales vítreos, es importante saber que pequeños cambios en la composición afectan su comportamiento drásticamente [9] Los vidrios pueden presentar buena bioactividad, ser reabsorbidos o permanecer inertes, dependiendo de su composición química [1]. Las vitrocerámicas son obtenidas a partir de los vidrios mediante un proceso térmico de desvitrificación (cristalización), controlando las temperaturas de nucleación y crecimiento [10].
El comportamiento bioactivo de los materiales vítreos consiste en una modificación superficial del implante, mediante una reacción que permite la formación una apatita hidroxicarbonatada biológicamente activa (HCA), la cual es química y estructuralmente equivalente a la fase mineral del hueso, permitiendo la unión interfacial con los tejidos [5-8].
Un material para la reconstrucción o sustitución de tejidos es considerado bioactivo si logra una respuesta biológica específica en la interfaz del material, dando como resultado una unión entre el material y los tejidos. Las bases de este comportamiento, es la reactividad química de los vidrios o vitrocerámicas con los fluidos del cuerpo humano [6,11-15].
Los fosfatos de calcio, en particular la Hidroxiapatita (HA), representan un alto porcentaje de la composición del hueso y los dientes, por lo que es empleada como material para implantes sin efectos citotóxicos, presentando excelente biocompatibilidad con los tejidos duros, músculos y piel, además de tener la capacidad de ligarse directamente al hueso [16,17].
En general, el mejor desarrollo de HA como material para implantes se obtiene empleando piezas porosas, ya que la porosidad favorece la adhesión celular y por consiguiente la formación de enlaces físicos, químicos y biológicos entre el material y el hueso, alcanzándose un anclaje mecánico, la fijación del implante al hueso y la formación de nuevo hueso [17].
Otros materiales que han sido ampliamente considerados como un material alternativo en la búsqueda de sustitutos óseos son los corales. El hecho que los exoesqueletos coralinos estén compuestos por aragonita, la cual es una fase alotrópica del CaCO3, brinda un alto grado de compatibilidad con el tejido óseo y con sus propiedades mecánicas [18].
]]> El objetivo de esta investigación es la comparación del comportamiento de la respuesta de bioactividad de tres tipos diferentes de biomateriales: vidrios y vitrocerámicas del sistema Na2O.K2O.MgO.CaO. SiO2.P2O5; Hidroxiapatita porosa y dos especies coralinas (Montrastrea Annularis y Porites Astroide) sumergidos en Fluido Simulado del Cuerpo (FSC) a diferentes tiempos.2. PArte EXPERIMENTAL
2.1 Materiales
2.1.1 Vidrios y vitrocerámicas
Las composiciones de los vidrios del sistema de Na2O.K2O.MgO.CaO.SiO2.P2O5 (Tabla 1), fueron diseñadas en base a los siguientes parámetros: el índice de bioactividad debe estar entre 8 y 10, SiO2 < 53%, Na2O y CaO = 20% para todos los vidrios, substitución parcial de Na2O y CaO por K2O y MgO respectivamente, a partir de estudios previos [15], y una proporción CaO/P2O5 de 5:1 con adición de B2O3 y Al2O3.
Tabla 1. Composiciones de los vidrios (% peso)
| Vidrio | SiO2 | ]]> K2O | MgO | P2O5 | B2O3 | Al2O3 |
| 1 | 49 | 4 | 4 | 0 | ]]> 0 | 1 |
| 2 | 49 | 4,3 | 4,2 | 2 | 0,5 | 0 |
| 3 | ]]> 48,5 | 4,3 | 4,2 | 2 | 1 | 0 |
| 4 | 48,5 | 4 | 4 | ]]> 2 | 1,5 | 0 |
| 5 | 48 | 4 | 3,5 | 2 | 1 | 1,5 |
De cada composición, se tomaron muestras de vidrio para realizar 3 ciclos de cristalización diferentes (Tabla 2) dónde se varió el tiempo de permanencia a la temperatura de nucleación (Tn = 550ºC) y a la de crecimiento cristalino (Tc = 750ºC).
Tabla 2. Ciclos de cristalización
| Ciclo | Tiempo de nucleación (min.) | Tiempo de ]]> crecimiento(min.) |
| 1 | 30 | 60 |
| 2 | 30 | 120 |
| 3 | 60 | ]]> 30 |
2.1.2 Hidroxiapatita
La HA empleada fue sintetizada vía precipitación del compuesto cristalino, empleando una suspensión de Ca(OH)2 y una solución de (NH4)2HPO4, tal y como lo describe la ecuación:
10 Ca(OH)2 + 6 (NH4)2HPO4 ® …
… ®Ca10(PO4)6(OH)2 + 12 NH4 + 12 H2O (1)
Siendo los precursores polvos comerciales de alta pureza. La solución de (NH4)2HPO4 se goteó en la suspensión de Ca(OH)2, bajo fuerte agitación, a temperatura ambiente. El producto se envejeció a 25ºC por 3 días a 125ºC. El material extraído del proceso se lavó hasta alcanzar un pH neutro, luego se secó en estufa por 24 horas entre 60 y 80ºC. Los polvos obtenidos se trituraron en mortero de ágata para separar los aglomerados.
En la preparación de muestras sólidas porosas se empleó un polímero como porosificador, el cual actúa también como aglomerante, favoreciendo el prensado y la distribución de los polvos de HA [19]. El polímero empleado fue alcohol polivinílico (PVA), con tamaños de partícula inferiores a 300 μm. Los polvos se mezclaron en proporciones volumétricas de 25 y 50% de polímero en matriz de HA en un molino de bolas, la mezcla fue tamizada de nuevo y se tomaron los polvos bajo 300 μm. La consolidación se llevó a cabo por prensado uniaxial a 50 y 100 MPa, sin precarga, para obtener pastillas, las cuales se sinterizaron a 1000 y 1200ºC por 12 y 24 hr.
Para el estudio de la bioactividad de HA se tomaron muestras aleatorias de pastillas sinterizadas, pulidas con alúmina de 5 m m.
2.1.3 Corales
2.2 Fluido Simulado del Cuerpo (FSC)
2.2.1 Preparación
La solución acuosa se preparó de acuerdo a las proporciones especificadas por Kokubo [7] en estudios previos, empleando los mismos reactivos de grado químico: NaCl, NaHCO3, KCl, K2HPO4.3H2O, MgCl2.6H2O, CaCl2 y Na2SO4. Estos se disolvieron en agua destilada ajustando el pH a 7,25 con la adición de 50 mM de un TRISMA (tris(hidroximetil)-aminometano (NH2C(CH2OH)3) y 45 mM de ácido clorhídrico (HCl).
2.2.2 Inmersión en el FSC
Todas las muestras fueron inmersas en el fluido contenido en material de vidrio esterilizado con temperatura y sellado para evitar contaminación. La temperatura del sistema se mantuvo a 36,5 + 5ºC, con la utilización de una resistencia y un termostato incorporado a la misma. Manteniendo una agitación leve, para mantener el fluido fresco sobre las muestras. Las cuales fueron extraídas después de un período de 2 y 4 semanas, con el fin de analizar el proceso de reacción.
2.3 Caracterización
Para la caracterización de las muestras, éstas se limpiaron cuidadosamente con acetona, y fueron embutidas en una resina al frío, para luego cortarlas transversalmente con disco diamantado. Las secciones transversales se pulieron con pasta de diamante de 1 m m, y se recubrieron con una película de carbono. El estudio de la superficie de reacción se llevó a cabo por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB), empleando barrido lineal por EDX en la superficie de las muestras, para el perfil composicional desde el substrato a la superficie.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Vidrios y vitrocerámicas
]]> Las reacciones entre el material bioactivo y el tejido, permite el desarrollo de capas ricas en SiO2, Ca y P. La capa rica en sílice se debe al intercambio entre los iones alcalinos ó alcalino térreos del vidrio o vitrocerámica, (Na+, K+ ó Ca2+, Mg2+) que se intercambian con los iones de hidrógeno (H+ o H3O+) provenientes del fluido simulado del cuerpo (FSC), este intercambio es fácil ya que los iones alcalinos ó alcalino térreos no son formadores de la red vítrea, ellos sólo la modifican. Es importante mencionar que durante este intercambio, el resto de los componentes del vidrio no se ven afectados. Luego de esta etapa hay una disolución interfacial de la red, que provoca la ruptura de los enlaces Si-O-Si, creándose enlaces del tipo silanol (Si-OH), en la superficie del vidrio en contacto con la solución de FSC. Ocurriendo luego rearreglos por policondensación de los grupos silanol vecinos, resultando en una capa rica en silicio, de gel de sílice, característica de los materiales bioactivos.La migración de iones Ca2+ y PO42+ del material a través de la capa rica en silicio, se depositan en la parte externa de la misma y originan la formación de una capa de fosfato de calcio, que posteriormente crece debido a la incorporación de estos mismos iones provenientes de la solución (FSC) [9]. Esta migración a través de la fase vítrea, se ve favorecida por los espacios dejados por la migración de los iones alcalinos.
Debido a lo mencionado anteriormente, como principal efecto de la inmersión del material vítreo en FSC se espera un intercambio iónico en la superficie del material, lo que da paso a la formación de una capa rica en silicio y una posterior migración de iones Ca+2 y PO4+2 desde el interior del vidrio hacia la zona más externa de la capa para formar apatita, que posteriormente (CaP) se convierte en HAP [7,12]. Los vidrios y vitrocerámicas se sumergieron por 2 y 4 semanas en FSC como se describió previamente, la formación de gel de sílica y la deposición de apatita obtenida se analizó por MEB-EDX.
En la Figura 1 se muestran los vidrios y vitrocerámicas estudiados con el análisis lineal por EDX superpuesto, luego de haber permanecido en el FSC por 2 semanas, diferenciándose varias zonas, de izquierda a derecha: la primera corresponde al material inicial antes del ensayo (vidrio ó vitrocerámica), luego una zona donde se aprecia un aumento significativo del silicio (barrido lineal por EDX), correspondiente a la capa de gel de sílice y por último en algunos casos, en la zona limitante con la resina (en negro) aparece disminución del Si y un aumento del Ca y el P (zona clara brillante), que corresponde a la deposición de apatita identificada en investigaciones anteriores [7,12,15]. Así, en la columna (a) de la Figura 1, se observan las diferentes composiciones de los vidrios, donde las composiciones 1 y 5 no muestran deposición de CaP, después de 2 semanas de estadía en el FSC. Estos vidrios 1(a) y 5(a), reaccionan para formar el gel de sílice en la superficie sin que ocurra el siguiente paso, debido a la presencia de Al2O3 1 y 1,5% respectivamente, que como se sabe es un estabilizador del material vítreo, aunque el efecto de la alumina en el 5(a) debiera ser contrarrestada por la presencia de 1% de B2O3, que actúa de forma contraria a la alumina. Por otro lado los vidrios de composición 2, 3 y 4 (Figura. 1, columna (a)) tienen además del gel de sílice una deposición evidente de apatita, (CaP) debido a la ausencia de Al2O3 en su composición.
Los vidrios de las diferentes composiciones fueron tratados térmicamente para transformarlos en vitro-cerámicas (compuestos de vidrio y fase cristalina), los cuales se comportan diferente en el FSC, dependiendo del grado de nucleación y crecimiento cristalino, producto de los tratamientos térmicos aplicados (ver Tabla 2), como se puede observar en la Figura 1, columna (b) primer ciclo de tratamiento, solamente la composición 3(b) muestra la
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deposición de Ca después de 4 semanas de inmersión en FSC, esto puede deberse a la presencia de 1% de B2O3 que promueve la deposición de HCA, las otras composiciones sólo muestran la formación del gel de sílica, y aunque la composición 4 tiene una mayor adición de B2O3, tiene menos K2O y MgO, ambos promotores de la formación de apatita. En las vitrocerámicas correspondientes al ciclo 2 (Figura 1, composiciones 1-5, columna (c)), sometidas a un menor tiempo de nucleación y un mayor tiempo de crecimiento cristalino, se puede observar que sólo las composiciones 2 y 4 permiten la deposición de la apatita sobre la capa de sílice. Y en las vitrocerámicas producto del ultimo tratamiento térmico (ciclo 3), con mayor tiempo de nucleación y menor tiempo de crecimiento cristalino (tabla 2), ver (Figura 1, composiciones 1-5, columna (d)); sólo ocurre deposición de CaP en la composición 4(c) con mayor adición de B2O3, mientras que para las demás composiciones sólo se muestra la formación de gel de sílice, (Figura 1, composiciones 1-5, columna (d)).
Los resultados entonces confirman el efecto de la composición, así como dan una idea de cómo afecta el grado de nucleación y cristalización, como ejemplo en la composición 3 sin presencia de Al2O3, se presenta deposición de CaP en el vidrio y en las vitrocerámicas del ciclo 1 y 2 con un mismo tiempo de nucleación, aunque en el ciclo 2 el tiempo de crecimiento cristalino es el doble, se deposita Ca y CaP respectivamente, mientras que para el ciclo 3 no hay deposición de CaP se infiere es por tener el doble del tiempo de nucleación que las anteriores y menor tiempo de crecimiento cristalino. Por lo que se puede deducir que es más importante la nucleación, porque al haber más núcleos se disminuye la fase vítrea que es la que permite la formación del gel de sílice, para el posterior intercambio iónico superficial necesario para la deposición de la apatita.
]]> En general, el efecto del tratamiento térmico depende más de la composición del material que del ciclo de cristalización empleado, observándose notables diferencias entre uno y otro caso. El análisis detallado de este efecto escapa de los objetivos de esta publicación, por lo que será discutido con más detalle en otra oportunidad.3.2 Hidroxiapatita
Las muestras de Hidroxiapatita presentadas en la Figura 2 muestran la presencia de calcio y fósforo en toda la muestra, lo que es de esperarse por la composición química del material. La Hidroxiapatita porosa permite un contacto mayor entre los fluidos que rodean el implante y el material, esto se debe a la gran cantidad de área superficial que le confieren los poros [17]. En las muestras estudiadas la posibilidad de intercambio de iones es permanente, debido a la porosidad de las mismas, por lo que se puede considerar a este material bioactivo.
3.3 Corales
Las muestras coralinas, presentadas en las Figuras 3 y 4, se puede observar que aparentemente son bioinertes, ya que su composición química no favorecerá la unión interfacial del material con los tejidos óseos. Es importante destacar, que no hubo enriquecimiento superficial de iones fosfatos en presencia del FSC, y tampoco se formó la capa de fosfatos cálcicos en la superficie de las muestras o entre los poros. Esto sin embargo, no descarta completamente el uso de corales como biomateriales, ya que una vez implantados en el cuerpo suceden varias reacciones enzimáticas que descomponen el carbonato de calcio y facilitan la integración ósea.
4. Conclusiones
Los vidrios y vitrocerámicas estudiados permiten la reacción de intercambio con el FSC, que se traduce en la aparición de la capa superficial de gel de sílice con la posterior deposición en algunos casos de una capa de apatita, lo que indica que en el primer caso pueden ser considerados biocompatibles y en el segundo caso bioactivos, en ambos existen las mejores posibilidades para evitar encapsulamiento del implante.
En los vidrios la composición (presencia o no de Al2O3, así como de B2O3), afecta fuertemente la bioactividad del material y en las vitrocerámicas provenientes de estos vidrios, además de la composición los tratamientos térmicos parecen tener cierta influencia también, por lo que deberán ser estudiados más ampliamente.
En cuanto a la Hidroxiapatita sintetizada, no se observó la formación de una capa de fosfatos cálcicos microestructuralmente diferente a la muestra de partida, por lo que este estudio no brinda conclusiones determinantes sobre la bioactividad de la misma.
Las especies coralinas estudiadas no mostraron diferencias en cuanto a la microestructura superficial, ni la formación de una capa de fosfato de calcio.
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Figura 2. Imágenes de MEB de la sección transversal con perfil composicional sobrepuesto de muestras de Hidroxiapatita, sumergidas en FSC: (a) HA de baja porosidad, 2 semanas de inmersión, (b) HA de baja porosidad, 4 semanas de inmersión, (c) HA de alta porosidad, 2 semanas de inmersión, (d) HA de alta porosidad, 4 semanas.
Figura 3. Imágenes de MEB de la sección transversal con perfil composicional sobrepuesto de muestras del coral Montrastrea Annularis, sumergidos en FSC por (a) 2 semanas y (b) 4 semanas. La zona más clara corresponde a la muestra y la más oscura corresponde a la resina
Figura 4. Imágenes de MEB de la sección transversal con perfil composicional sobrepuesto de muestras del coral Porites Asteroide, sumergidos en FSC por (a) 2 semanas y (b) 4 semanas. La zona más clara corresponde a la muestra y la más oscura corresponde a la resina.
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